MIBP1基因敲除载体的构建

MIBP1基因敲除载体的构建 天津医药2007年1O月第35卷第1O期 MIBP1基因敲除载体的构建 王维兰孙立军陈喜文刘健只达石陈德富 755 摘要目的:构建MIBP1基因敲除载体.方法:以小鼠129胚胎干细胞基因组DNA为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,根据 GenBank注册 序列,扩增小鼠MBP一2基因启动子区5端片段(5arm)和内含子区3端片段(3alTl1),然后分 别克隆进敲除载体 pKOScramblerNTKV一1906,酶切鉴定后即得到MIBP1基因敲除载体pNTKV一3,5arln.用SalI对pNTKV一3,5 alTll线性化,用于胚胎干细胞电转染.结果:成功扩增并克隆到小鼠129胚胎干细胞MBP一 2基因的5alTll和3a肿 片段,构建了MIBP1基因敲除载体.结论:成功构建了MIBP1基因敲除载体. 关键词MIBP1基因小鼠,基因敲除胚胎干细胞遗传载体质粒 TheConstructionofMIBP1GeneKnock-outVector WANGWeilan,SUNLijan,CHENXiwen,LIUJian,ZHIDashi,CHENDefu KeyLaboratoryofBioactiveMaterials,MinistryofEducation,CollegeofLifeSconces, NankaiUniversity.Tianjin3DD07J.ina AbstractObjective:ToconstructMIBP1geneknock—outvector.Methods:The5aEfflofpromoterand3alTllof intronofmiceMIBP1genewasamplifiedfrom129embryostemceUsgenomeDNAandclonedintovect orpKOScrambler NTKV一 19o6.Afterrestricfionenzymeconfirmation.theMIBP1geneknock—outvectorwasconstructedandnamedpNTKV一 3.5arin.ThevectorwaslinearlizedbySo/IfortransfectionofembryostemceUs.Results:The5armand3a lTllofthe 129embryostemcellMIBP1genewereamplifiedandcloned.TheMIBP1geneknock—outvectorwasconstructed. Conclusion:MIBP1geneknock-outvectorwasconstructed. KeywordsMIBP1genemice,knockoutembryostemceUsgeneticvectorsplasmids MIBP1是c—myc上游调控基因之一,在前期工 作中笔者检测了该基因在人脑胶质瘤中的表达情 况,并对该基因进行了测序分析fl,2】.同时,笔者构建 了其表达载体,转染到胶质瘤细胞中,观察到该基 因具有明显的抑瘤作用.为进一步研究该基因功 能,本文构建了置换型MIBP1基因敲除载体,为建 立MIBP1基因敲除动物模型打下基础. 1材料与方法 1.1实验材料小鼠129胚胎干细胞基因组DNA(ESDNA) 为本室自制.大肠杆菌菌株DH5a-F’r为本室保存,pMD18-T, ExTaq~DNA聚合酶,LATaq~DNA聚合酶,T4DNA连接 酶,限制性核酸内切酶及蓝白筛选试剂购自宝生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 (大 连)有限公司,pKOScramblerNTKV一1906购自Stratagene公 司.dNTPs购自Clontech公司,引物合成委托宝生物工程(大 连)有限公司,其他试剂均为国产分析纯. 1.25端短片段(5arm)和3端长片段(3arm)扩增与克隆比 对GenBank注册的AC091764序列保守区,设计扩增小鼠 MBP一2基因启动子区5alTll和内含子区3alTll引物,见表 1.PCR体系为15,含1.510XPCRbuffer,1.2L2.5 mmol/LdNTPs,1ESDNA,0.18L10I~mol/L上游引物, O.1810I~mol/L下游引物及0.0755U/LToq@DNA聚 合酶.PCR条件为:94?预变性5min后,35个三温度循环 (94?变性40s,54oC退火32s,72oC延伸2-4min),72oC再 延伸7min. 表1用于扩增5arnl和3arnl的引物序列 引物序列(5一3) KpnI XhoI BclI Sac11 CGGggtaccGCATrACCACACAGGCTACG CCGctcgagATCATCAAAAGACTCTGGAGAGA CTGAGTrtgatcaTrAGTCCCATCTCACCAACCTATC TCCccgcggCAGGGCATATGACATAG33”CC 注:小写字母为酶切位点 PCR产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳分离,并用冻融法回 收,回收产物分别插入到载体pMD18-T中,并转化进大肠杆 菌DH5a—FI”感受态细胞中,蓝白斑筛选后通过质粒PCR和 酶切等手段筛选阳性克隆.得到的重组质粒分别命名为 pMD18—3arm与pMD18-5arm.将质粒pMD18—3arm转化 天津市科学技术委员会应用基础研究重点资助项目(项目编 号:033800911) 作者单位:300071南开大学生命科学学院生物活性材料教育 部重点实验室(王维兰,陈喜文,刘健,陈德富);天津市环湖医院神 经外科(孙立军,只达石) 通讯作者E—mail:chendefu@nankai.edu.cn 756 进甲基化缺陷型大肠杆菌菌株ER2925中,提取质粒得到甲 基化缺陷的pMD18—3ann(一),此质粒能够被甲基化敏感的 限制性内切酶BclI进行切割. 1.3基因敲除载体的构建首先将pKOScramblerNTKV一 1906和pMD18—38rln(一)分别进行BamHI/Sac?,BclI/ Sac?双酶切,酶切片段回收后用T4DNA连接酶进行连接, 并转化进大肠杆菌DH5ct—fTr感受态细胞中,通过质粒PCR 和酶切等手段筛选阳性克隆,得到的阳性重组子命名为 pNTKV一3arm.然后再将pNTKV一3ann和pMd18—5ann分 别进行KpnI/XhoI双酶切,片段回收后用T4DNA连接酶 进行连接,并转化进大肠杆菌DH5ct—FT感受态细胞中,通过 质粒PCR和酶切等手段筛选阳性克隆,得到的阳性重组子命为 pNTK-3,5al-m.最后用限制性内切酶SalI将重组质粒 pNTKV一3arm线性化: 2结果 2.15aim和3aim的扩增以小鼠ESDNA为模 板,扩增小鼠MBP一2基因启动子区和内含子区,用 引物对KpnI/XhoI扩增后得到5arm(1891bp, 122404,120516,包含MBP一2基因开放阅读框架 的5侧翼序列),用引物对BclI/SaclI扩增得到 3arln(3727bp,112377,108652,包含MBP一2基 因第3内含子序列).扩增结果见图1,显示扩增片 段的大小与预期符合. M:h-EcoT14IdigestDNAMarker(从上到下依次为19329,7743, 6223,4254,3472,2690,1882,1489,925,421,74bp);1:5aim扩增 带;2:3arm扩增带 图1用PCR方法扩增条带5aim和3aim 2.2基因打靶载体的构建将pKOScrambler NTKV一1906与pMD18—3arln分别进行BamHI/Sac ?和BclI/SacII双酶切,然后连接两片段使3anti TianjinMedJ,Oct2007,Vol35No10 插入到pKOScramblerNTKV一1906特殊位点,质粒 PCR和酶切等手段筛选阳性克隆子,得到的重组 质粒命名为pNTKV一3arln,其酶切分析图谱见 图2,显示酶切片段大小与预期相符,证明其构建 是成功的. M:k-EcoT14IdigestDNAMarker(从上到F依次为19329, 7743,6223,4254,3472,2690,1882,1489,925,421,74bp);1: NdeI;2:EcoRI:3:PsiI;4:XhoI:5:KpnI 图2重组子pNTKV一3arm酶切图谱 将质粒pNTKV一3arm与pMD18,5arm分 别经KpnI/XhoI双酶切后,连接两片段使5 al3Tl插入到pNTKV一3arln特殊位点,质粒PCR 和酶切等手段筛选阳性克隆子,得到的重组质粒 命名为pNTKV一3,5arm,其酶切分析图谱见图 3,显示酶切片段大小与预期相符,证明其构建是 成功的. M:h-EcoT14IdigestDNAMarker;1:PstI;2:BamHI;3: I:4:XhoI;5:SalI;6:NotI;7:KpnI/XhoI;8:Hindlll/XhoI;9: BamHI/SalI 图3重组子pNTKV一3,5a?l酶切图谱 天津医药2007年1O月第35卷第1O期 3讨论 在”后基因组时代”,基因功能研究越来越受 重视,通过基因的改造和干预治疗疾病造福于人 类,基因功能研究是必经阶段.基因敲除技术【3]是 20世纪80年代后期发展起来的特异性敲除特定 基因的技术.该技术定位性强,是一种理想的修 饰改造生物遗传物质的方法,使人们有可能真正 按自己的设想去改造生物的遗传物质,并能稳定 遗传,具有其他研究方法无法替代的作用,在基础 研究和实际应用中都有着广阔的前景.在胶质瘤研 究领域,近20年来国际上已对p53,神经生长因子 受体(NGFR)等基因进行了基因敲除实验,并进行 了大量的研究,但基因敲除领域在国内尚处于起步 阶段,可喜的是近年来有增多趋势. MIBP1(c—myc内含子结合蛋白1)基因【41编码 一 个2437个氨基酸的高度保守的锌指蛋白,定 位于人类染色体6q23,24,在脑组织中高水平表 达【51.表达的蛋白是一个功能广泛的转录因子【61, 能与c—myc内含子1中的顺式调控元件MIF1结 合,形成复合物,在myc基因的一个异源启动子 上显示出沉默子活性【7],促进沉默子抑制c—myc 表达,纠正肿瘤中myc基因的过量表达.在笔者 的诱导分化模型中其表达与胶质瘤细胞分化呈 正相关,有望成为胶质瘤基因治疗的候选基 因,值得进一步对其功能进行深入系统的研究. 基因敲除载体多为质粒载体,本文选择了 pKOScramblerNTKV一1906载体,含有两个多克隆 位点,正筛选基因础.和负筛选基因HSV—tk.置 换型载体(replacementvector)含有与目的基因位 点同源(isogenic)的DNA序列,即同源序列 (homologoussequence),抗药基因neo位于同源序 列之间,线性化位点位于同源区域的外侧,载体 序列与目的基因序列呈共线性关系,这样基因组 序列通过两次交换事件被载体上的同源序列和 neo基因所替代. 基因敲除载体的同源序列分为3ann和 5ann,一般认为长片段应在2,5kb,短片段至少1 kb.片段越长重组率越高,但克隆难度比较大;片段 越短越容易克隆,但重组率较低嘲.本文的实验设计 是符合上述要求的,最终成功地构建出MIBPI基因 的敲除载体. 长片段PCR困难很大,既要实现片段的完整扩 757 增,又要求很高的保真性,本文采用了高保真的 DNA聚合酶最终解决了这些问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 .在载体质粒构建 过程中笔者发现,空载体质粒的SalI位点难以切 割,经反复探索,认为是质粒甲基化修饰所致,在实 验中改用甲基化酶缺陷型菌株扩增质粒后,问题得 以解决. c—myc基因是近年研究热点[91,尤其在细胞遗 传学和分子遗传学领域有大量报道,指出其是人脑 胶质瘤中突变或异常表达率高的基因之一,尤其常 见于儿童胶质瘤和多形胶质母细胞瘤,其调控通 路的异常可能是胶质瘤发病的一个重要原因.对于 c—myc的调控虽然研究时间已经较长,但仍无完整 确切定论.本文构建的MIBP1基因敲除载体,为建 立MIBP1基因敲除动物模型打下坚实基础,这将会 有力推动myc基因功能研究及其异常致癌机制研 究,并将为胶质瘤基因治疗提供新思路. 参考文献 [1】孙立军,黄强,王爱东,等.应用差异显示技术克隆胶质瘤细胞 诱导分化相关基因[J1.中华神经外科杂志,2003,19(2):89—92. 【2】黄强,孙立军,董军,等.人脑胶质瘤诱导分化相关基因体外实 验的初步研究[J1.癌症,2003,22(7):673—679. 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