细胞培养与生长测定

细胞培养的生长测定细胞培养的生长测定是指对细胞活力和细胞增殖的测定1.细胞计数法2.台盼蓝染色法3.MTT比色法4.细胞生长曲线法一、细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞密度。【材料】1.消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液2.细胞培养液3.血细胞计数板和盖玻片【操作程序】处理贴壁生长细胞时，吸出培养液，加入消化液，在37℃条件下消化1-2min。待细胞变圆并将脱壁时，加入一定量的培养液，用吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。对于悬浮培养的细胞，可直接制成细胞悬液。将盖玻片放在血细胞计数板的2个小室上。用毛细吸管或装有注射针的1ml注射器吸取少量细胞悬液，然后将细胞悬液轻轻注入盖玻片边缘与计数板交界处。通过盖玻片和计数板之间的毛细管虹吸作用，细胞悬液进入小室，并充满盖玻片和计数板的间隙。3.在显微镜100倍放大倍数下用计数器计数四角大方格中的细胞数，即每个小室的中央方格和四角的方格。将压左边中线和上边中线的细胞计数在内，不计数压在右边中线和下边中线的细胞。4.计数结束后，分别用双蒸水和70%酒精清洗细胞计数板和盖玻片，然后用擦镜纸擦干。结果分析细胞密度（个/ml）=平均细胞数×104×稀释倍数。细胞总数（个）=细胞密度×细胞悬液量 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 如果被计数的细胞不再使用，在消化后不需要加入培养液。在显微镜下观察细胞消化程度，以估计取细胞时间。消化时间过短时，部分细胞仍牢固贴壁，故取得的细胞较少，从而影响细胞计数。消化时间过长时，细胞受损，活性减弱。将细胞悬液充分混匀，以免计数结果出现偏差。向盖玻片和计数板之间注入细胞悬液时，以盖玻片下的间隙刚被充满为准。不满或过满都影响实验结果。每个大方格中的细胞密度以20-50个为宜。如果细胞密度太大，稀释后再次计数，以便提高细胞计数的精确度和速度。二、台盼蓝染色法在细胞的分离、传代、冻存和复苏等过程中，均可导致细胞的死亡。台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。【材料】消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。培养液或HBSS。0.4%台盼蓝溶液，用PBS配制。细胞计数板和盖玻片。【操作程序】处理贴壁生长细胞时，吸出培养液，加入消化液，在37℃条件下消化1-2min。待细胞变圆并将脱壁时，加入一定量的培养液或HBBS，用吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。对于悬浮培养的细胞，可直接制成细胞悬液。取0.5ml台盼蓝溶液，0.3mlHBBS和0.2ml细胞悬液，充分混匀。然后，将混合液放置1-2min。用毛细吸管或装有注射针的1ml注射器吸取少量细胞悬液注入盖玻片边缘与计数板交界处。至少计数500个细胞，并计数其中着色细胞。计数结束后，分别用双蒸水和70%酒精清洗细胞计数板和盖玻片，然后用擦镜纸擦干。【结果分析】正常细胞不被着色。细胞死亡后，细胞膜通透性增加，台盼蓝进入细胞内，故细胞呈蓝色。细胞活力（%）=（细胞总数-着色细胞数）/细胞总数×100%注意事项如果含有台盼蓝的细胞悬液放置时间过长，正常细胞可摄取染料，从而影响染色结果。台盼蓝染色法是一种粗略的检测存活细胞的方法，不能准确的反映细胞活性的差异。因此，应使用MTT比色法或凋亡检测法评价细胞活性或检测早期凋亡细胞。三、MTT比色法ＭＴＴ法建立于20世纪80年代初，是一种通过测定细胞能量代谢水平用以间接反映细胞增殖情况的检测方法。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲瓒(Formazan)，将结晶的甲瓒溶解释放，再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值，OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。活细胞多则吸光度大，反之则吸光度小，从而反映出你的细胞的存活及增殖情况。它基于两个假设：1、只有活细胞能够将MTT还原成为难溶性的蓝紫色结晶物，而死细胞不能达到；2、其吸光度与活细胞数量成直线正相关。【材料】1、MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50mlPBS(0.01mol／L，pH7.2)，在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃避光保存。两周内有效。2、含10％胎牛血清RPMl1640培养液、0.25％胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)3、96孔培养板(单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板)、可调移液器、吸管、离心管、计数板4、孵箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪【操作程序】1、接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMl604培养液配成单个细胞悬液，以每孔100－1000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。2、培养细胞；将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及湿度条件下，培养3-5天。3、呈色：培养第2-5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/m1)20ul，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对浮生长的细胞，需离心,(1000rpm．5min)，然后弃去孔内培养液每孔加入150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线。注意事项1、选择适当的细胞接种浓度。由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测定其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证适时终止细胞培养。这样，才能保证MTT结晶形成量与细胞数呈的线性关系。2、避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。因此，一般选小于l0％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。3、设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白孔。其它试验步骤保持一样。最后比色时，以空白孔调零。4、加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。5、如果用96孔板，周围一圈孔的值由于液体蒸发和温度梯度原因，存在明显的挥发现象，会误差很大，所以做的时候要求培养箱里的湿度条件控制的比较好,要不就需要弃取周围两轮孔的数据。6、MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护。【结果分析】细胞存活率=试验组OD/对照组OD×100%已开发出新的方法（如CCK-8法）替代传统的MTT法，优点有：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；3、CCK-8法的重复性优于MTT法；4、CCK-8法对细胞毒性小。四、细胞生长曲线法原理：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止生长，进入平顶期，然后退化衰老。典型的生长曲线即可分为潜伏期、指数生长期、平顶期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相（潜伏期、指数生长期和平顶期）是每个细胞系所共有的特征。意义：通过测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。【材料】24孔培养板。细胞悬液。消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。培养液或HBSS。细胞计数板和盖玻片。【操作程序】计算细胞密度2次，得出细胞密度平均值。然后，将细胞悬液等量加入培养板的每个孔中，培养时间计为0天。每隔24小时吸去3个孔的培养液，加入消化液，混悬细胞，计算细胞数目。每个孔计数2次，得出细胞密度平均值。连续7天，绘制细胞生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞密度。【结果分析】细胞生长曲线反映细胞的生物学特征。每一代细胞的生长过程可大致分为潜伏期、指数生长期和停滞期。潜伏期细胞对分离和传代操作所致损伤的恢复以及适应新生长环境的过程。一般来讲，原代细胞培养需要24-96小时，甚至更长时间才能恢复增殖。不同细胞的增殖恢复所需时间不同，传代细胞的潜伏期一般为6-24小时。指数生长期：细胞数量呈对数增长。指数生长期一般为3-5天。停滞期：细胞最后长满形成单层，不再增殖，生长停滞。注意事项培养板内各孔细胞的消化操作过程要一致，避免得出细胞密度有明显差异。细胞计数前，尽量使细胞混悬均匀。细胞生长测定的应用细胞增殖或细胞活性测定药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定细胞冻存与复苏原理在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。当细胞被冷至-5℃时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-15℃之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。冷冻保存温度冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。从实际和效益的观点出发，液氮温度（-196℃）是目前最佳的冷冻保存温度。在-196℃时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196℃下均可保存十年以上。应用-70℃～-80℃保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-40℃范围内保存细胞的效果不佳。复苏速率复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。冷冻保护剂冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。目前多以渗透性冷冻剂较为常用DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4℃时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在4℃下进行，一般需要40～60分钟。冷冻保存方法按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70～-80℃，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-100℃以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。非玻璃化冻存方法【材料】1.仪器设备：普通冰箱、低温冰箱和-70～-80℃超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；2.冻存管：容量为1ml或1.5ml；3.冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解；4.待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。【操作程序】1.待冻存细胞悬液的制备(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；(2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；(4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；(5)再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。2.分级冷冻先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～8℃），约40min；接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-10℃～-20℃），约30～60min；将冻存管转入低温冰箱（-40℃），放置30min左右；然后将冻存管转移到超低温冰箱（-70℃～-80℃），过夜；最后将冻存管投入液氮保存。3.记录做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。非玻璃化冻存的复苏方法主要材料（1）仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；（2）培养用液：完全培养液。复苏过程（1）调配37℃～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37℃～40℃；（2）从液氮中取出冻存管，立即投入37℃～40℃温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；（3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；（4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。【注意事项】细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。