红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（H
红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集
抑制试验(H
红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
一.准备
1. 抗凝剂的配制:用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。(没用完的,可放在冰箱4?保存,使用前要高压灭菌消毒)
2. .1,红细胞悬液:由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内(按抗凝剂:全血,1:2的比例)，迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4,5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4?冰箱中可保存2—3天。使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。 3. 被检血清:每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。(注:我用的是蛋黄,较血清低1个滴度。做法:蛋黄和生理盐水1:1稀释，备用)
二.过程
(一)血凝(HA)试验:采用96孔V型反应板，测定抗原效价 1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升。
2、用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升。
3、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25微升。 4、置于微量振荡器上振荡1分钟。
5、室温静置30分钟后观察结果。
6、结果观察:将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，
表
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明红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效
价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如果到第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1:256。
(二)4单位抗原校正:
1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液:即4单位抗原。
:抗原效价为1:256，HI试验时，25微升抗原稀释液内须含4个凝例:上图1
集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理盐水。
2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升。第一孔不加。
3、用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25微升。
4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25微升。 5、于微量振荡器上振荡1分钟。
6、室温静置30分钟后观察结果。
7、结果观察:第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。 (三)血凝抑制(HI)试验:每排孔检查1份血清。步骤如下: 1.用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中。
2.用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。
3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升。
4.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
5.室温静置20分钟。
6.用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升。
7.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
8.室温静置40分钟后观察结果。
四、结果判定:
1)判定结果:以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。
2)判定
标准
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:
1.新城疫抗体:育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上。
2.H5抗体:抗体值在6以上。
3.H9抗体:抗体值在7以上。
注:低于以上标准，则需要进行免疫。
3)免疫后抗体规律
-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持2个月。灭一般活疫苗免后7
活疫苗免后10-15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月。 五、实验后的用具处理:
1、96孔V型反应板的清洗:
新反应板可直接放入清洁液中浸泡24小时，用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物，然后泡在清洁液中，24小时后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤干备用。属塑料制品，70?以下烤干。
2、微量滴头的清洗:
新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中，最少浸泡24小时，捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烤干，备用。属塑料制品，70?以下烤干。
3、吸管及积液槽的清洗:
将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24小时后捞出，用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干，吸管放入高温干燥箱中160?干燥1—2小时后备用，玻璃制品可高温烤干。积液槽放入恒温箱中烘干。
浙公网安备 33021202002483