底物和核酶的序列对核酶作用的影响

底物和核酶的序列对核酶作用的影响 底物和核酶的序列对核酶作用的影响 底物和核酶的序列对核酶作用的影响. . 宋任涛李矗/盎海翎张庆琪许政皑"' (中言;再i磊I茹;j;五西荔究所植暂分子遗传国家重点实验室,200032) I口摘要 两个分别由3个单价棱酶RZl,RZ3和RZ4按不同的顺序串联而构成的三价棱酶 RZl34和RZ413,都能在体外分别专一切割烟草花叶病毒(TMV)RNA上3十不同位置的 底物序列,对各个底物的切割效率及专一性与其相应的单价棱酶相似.当3个棱酶底物混 台后被再作用时,三价核酶只 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现出明显的单元棱酶RZ4的活性.而其他2个单元棱酶 RZI和RZ3的活性大大减弱.这种活性的减弱是由于RZl和RZ3所对应的底物BT2(+) 和n'r-z()在靶区形成了艰链,从而阻碍了RZI和RZ3棱酶序列与二者形成切割所必需 的空间结构.此外.还意外发现了RZl对BT4(一)的多位点切害j作用. …盥警黼声活性底移?劂/.核酶(ribozyme)是指一类具有催化活性的RNA分子_1J.其中有一类核酶催化专一 切割单链RNA[".它的催化活性依赖于其RNA与对应的靶序列形成一个正确的催化结 构.影响这一结构形成的任何因素都有可能对核酶的作用产生不利的影响. 我们曾根据"锤头型"核酶模型L…,以TMv正链和负链RNA上的部分序列为靶台成 了数个核酶[.15_.其中RZ2因其靶位点位于一段有紧密结构的序列中,而不能起作用. 为此,我们曾讨论过设计核酶时应注意底物序列的自身结构14J. 为了克服核酶的低催化教率的问题,我们施行了多价核酶的设想_5J.多价棱酶由多 个不同的单价核酶相串连而成.但是由于串连了多个单元核酶,所以单元棱酶间的相对 位置.及由此带来的可能的结构上的相互作用是否会影响单元棱酶的有救作用?植物 RNA病毒在体内复制时,要经历一个部分双链结构的RF或RI阶段"J.这使得靶位点 所在序列会形成暂时的,非自身序列决定的高级结构.这些结构对棱酶的作用会有怎样 的影响?这些问题都是本文试图回答的. 材料和方法 11材料 核酶体外转录质粒pGRZl,pGRZ3,pGRZ4,pGRZ34,pGRZl3和底物体外转录质粒, pBT2(+),pBT2(),pBT4(一)均为本实验室自行构建..";限制性内切酶类,T4DNA 聚合酶,T4DNA连接酶,T7RNA聚合酶购自华美生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 公司;:?一'H]一ATP购自NEN 公司. 1.2方法一 1.2l栽体克隆方法参照《分子克隆实验指南)(第2版,科学出版社,1992). 1.22体外转录体外转录按照许等[.:的方法进行.一 1.2.3核酶反应核酶反应条件及其反应后处理参照许等的方法.".每个反应内的. 核酶和相应的底物数量各为01pmol.X光片上的放射自显影图像经惠普激光扫描仪 (HPscanjetplus)扫描输入电脑,再由惠普激光打印机(HPlaserjet)打印成像c 结果 2.1三价核酶载体pGRZl34和pGRZ413的构建, 两个三价核酶RZl34和RZ413均由单元核酶RZl,RZ3,RZ4以不同的次序串连而 成.在RZl34中,由5.至3'依次分别为RZl,RZ3,RZ4.而在RZ413中,由5'至3'依次. 为RZ4,RZl,RZ3.三价核酶载体pGRZl34和pGRZ413的具体构建如图1所示. 第1期底物和棱酶的序列对棱酶作用的影响 22体外转录 三价核酶转录载体pGRZ134和pGRZ413经EcoRI线性化后,用T7RNA聚合酶参 照许等_4的方法进行体外转录.相应的H—ATP参人标记的底物RNAlBT2(+),BT2 (一),BT4(一)]及其他核酶(RZ1,RZ3,RZ4,RZ13和RZ34)的体外转录参见文献[4,5]. 体外转录FGRZ134所得的三价核酶RZ134,其中的3个单元核酶:RZ1,RZ3和RZ4 各长54nt,54nt[和52nt[,从5至3端依次连接.单元RZ1与RZ3之间相隔2nt (AC),RZ3与RZ4相隔6nt(GGAUCC),在三价核酶上游和下游还有部分碱基转录自载 体DNA,所以转录得到的三价核酶RZ134全长为223nt. 另一个三价核酶RZ413转录自载体pGRZA13,3个单元核酶RZA,RZ1和RZ3从5 至3端依次排列.RZ4与RZ1相间9nt(GGGGAUCCU),Rz1与RZ3相隔6nt (GGAUCC),包括两端转录自载体的序列在内三价核酶RZ413全长为226nt. 2.3三价核酶对底物BT2(+),BT2(一)或BT4(一)的作用 BT2(+)和BT2(一)均长约470nt,BT2(+)经对应核酶RZ1切割产生长约315和 155nt的产物片段;BT2(一)经对应核酶RZ4切割产生长约370和103nl的产物片段. BT4(一)长约300nl,经对应椤酶RZ4切割产生长约200和95nt的产物片段.三价核酶 RZ413和RZ134对单个底物的切割作用结果列于图2内. Fig2CleavageofJnttividual5ubstratesbythevarious^l TheSUbsirateBan(+)(1—4).Ban(一)(5—8)andBT4【一)【9—12)wEin~hstedat37? f[不1hwithn0?bc (4.8,l2)OTthetTi—oomponentrlbozymeRZ413(1.5.9)andRZI34 【2.6.10)orthemone-rilx~yrneRZl(3),RZ3(7)and RZ4f11?controlsThenumberOiltheleftd目totheandbarsrepresentthslengthsinnucleotideofthesuJ06trates andcl~vageproclurts.Thebarsindicatetheunexpectedcleavageproducts RZ413(第1列)和RZ134(第2列)都能把绝大部分的长为470nt的底物BT2(+) 生物化学与生物物理第29卷 (见第4列的空白对照)切割生成长约315和155nt的两个片段.它们与作正对照的单价 核酶RZ1(第3列)切割BT2(+)的产物完全吻合,其切割效率也与单价核酶相似.显然, 单元核酶RZ1在三价核酶内的位置对其作用并无明显影响. 对于底物BT2(一)(见第8列的空白对照),三价核酶RZ413(第5列)和RZ134(第6 列)也能切割,生成的产物370nt和103nt两个片段与单价核酶RZ3(第7列)的作用产 物完全一样但RZ134(第6列)切割产生的370nt片段略比RZ413(第5列)的强,其原 因是由于RZ134不能与切割产物370nt形成1000nt大分子片段(第6刊),而RZ413和 RZ3都能与一部分370nt形成1000nt大分子片段(第5,7列).有证据表明(结果未显 示)1000nt大分子片段的形成是与核酶的旁接序列密切有关.RZ134的旁接序列略有改 变,以致不能形成1000nt大分子片段.比较不参与大产物形成的3'103nt切割产物,则 RZ134与RZ3,RZ413是相一致的.所以串连后的单元核酶RZ3在切割效率和专一性上 也保持不变. 当与底物BT4(一)(见第l2列的空白对照)作用时,RZ413(第9列)和RZ134(第lO 列)能把底物切割出与单价核酶RZA(第11列)作用完全一样的两个片段(200和95tit), 其作用效率与单价RZ4无明显区别.但是两个三价核酶与RZ4不尽相同,它们(第9, 1O列)还少量切割出两条估计长度为120和80nt左右的额外的产物片段(用横线表示). 后面的实验将对这种额外的产物片段作进一步的解释. 24核酶对3个底物混合物的作用 为研究核酶在多种RNA分子存在的复杂情况下是否仍能对其底物施行有效的专一 切割作用,我们把底物BT2(+),BT2(一)和BT4(一)混合在一起以观察各个单价,双价 和三价核酶对该混合物的切割作用情况.其结果表示在图3中. 图3中的第1至3列为底物BT4(一),BT2(+)和BT2(一)混合前的情况.一旦把 相当量的3个底物相混合后(第4列),大量的RNA仍滞留在加样孔内(粗横线表示),与 B1,2(+)或BT2(一)相当位置的RNA量大大减少,而只有BT4(一)的量基本不变.应当 指出,132"2(+)和BT2(一)是分别转录自同一DNA 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 的两条互补链4J,因此它们在混 合后可退火形成局部双链,形成十分稳定的,结构复杂的大分子,在电泳时无法进人凝 胶.电泳前的加热变性处理(终浓度大于5O%的甲酰胺及65?5分钟)都不能破坏这些 结构. 图3中的第12至l4列表示底物BT4(一),BT2(一)和BT2(+)分别被相应的核酶 RZ4,RZ3和RZ1作用后生成的产物情况.对于RZ4(第5列),混合底物并没有影响它对 底物BT4(一)的专一切割作用.生成的200和95nt两个片段与单一底物的切割对照(第 l2列)完全一致.而RZ3对混合底物内的BT2(一)的切割(第6列)则比对单一的BT2 (一)的切割对照(第13列)大为减弱;它对混合底物内的BT4(一)未发生作用.至于在 RZ1对混合底物的反应产物(第7列)中,未能发现预计的切割产物,但却意外地发现了 长度约为260,180,140和120nt不等的来源不明的切割片段(横线所示). 当双价核酶RZ13作用于混合底物时(第8列)少量的RZ3专一切割产物(370和 103nt)可以被观察到,其数量与单价RZ3的作用产物相似.在反应产物中,还有前述的 来源不明的4个切割片段,其数量与单价RZ1的相似.据此推测这4个片段可能与RZ1 第i期底物和校酶的序列对桉酶作用的影响 的作用有关.双价核酶RZ34(第9列)非常有效地作用于混合底物中的BT4(一),生成 的产物(200和95nt)与第12列的对照结果一致.RZ34对混合底物内的BT2(一)的弱 的切割作用也可被观察到,其切割强度与单价RZ3(第6列)或双价RZ13(第8列)的结 果相似. 三价核酶RZ134(第10列)和RZ413(第11列)都能有效地切割混合底物中的BT4 (一),其效率与单价(第5和12列)和双价(第9列)几乎一样二者对BT2(一)较弱的切 割作用可被观察到.但是这两个三价核酶内的单元RZ1都未能对混合底物内的BT2 (+)施行专一切割,代之的是两个长约120和80nt的不明产物.它们与圉2中第9,10 列中三价核酶切割BT4(一)产生的两个额外产物片段是一样的.因此可断定该两 个片 段是三价核酶对混合底物内BT4(一)发生切割后生成的.然而,值得注意的是,单价RZ1 (第7列)和双价RZ13(第8列)也对混合底物有不明的切割作用,但其产物的大小,除 了120nt以外,显然与上述的是不同的.其中3个较大片段260,180和140nt是三价核 酶作用所没有的;而三价核酶作用后的小片段80nt也没有在单价RZ1或双价核酶RZ13 作用反应中出现. Fig.3CIeavages0fthemixedSUbtratesbyvariousb0n髓 Individualsuhsu'atesofBT4(一)(1,12).BT2(一)(2,13)andBT2(+)(3.14)orthemlxtureofth ethreesu[~trates(4— 11)wincubatedat37?r1hwithnonb亡毋呵n(1—4)01"themotnb亡帅eP,Z4(5,12).RZ3(6,13)andRZI(7, 14).rthedbec~poneatbo皓RZ13(8)andRZ34(9)Orthetr一p0nentribozymesRZI34(10?andRZ413(Ii).The numberso力theMtsidestothe—andbarsrepresentthelengthsinnmdeofthesuracanddeavagepmdu~s 2.5核酶RZI对底物BT4(一)有专一的多位点切割作用 在结果2.3和2.4中,核酶RZ1和底物BT4(一)同时存在时,就会出现一些额外的 产物片段.这些额外产物可能来源于RZ1对BT4(一)的切割作用.我们研究了RZ1和 BT4(一)的作用情况,结果如图4所示.RZ1和BT4(一)共同保温后(第2列),的确出现 了4个产物条带,其数量和大小均与RZ1(圉3第7列)或RZ13(圉3第8列)对混合底 物作用后形成的产物条带是一致的,所以RZl对BT4(一)确有切割作用.这些切割的产 生物化学与生物物理第29卷 物显然与专一核酶RZ4的切割产物(第3列)不同.BT4(一)经三价核酶RZ134或 RZ413(第4或5列)切割后可形成多个产物.其中的两个产物条带是RZ4的作用结果; 一 个产物是RZ1的作用结果;而另两个较小的产物(80,60nt),按大小推算,是较大的那 两个RZ1作用的产物被RZ4再度作用的结果. 讨论 核酶切割RNA的高度专一性使核酶有可能成为抗植物病毒病的一个育种途径.为 在整体上提高核酶的作用效率,我们施行了多价核酶的设想并已报道了二价核酶体外作 用的情况【5.这些双价核酶具有与相应的两个单价核酶相似的作用效率并兼备了该两个 单价核酶的专一巨.但单元核酶在三价以上的核酶中的位置是否会影响其作用专一性和 效率?在利用核酶抗HIv病毒病的研究中有人 报道了多价核酶没有影响其中各个单元核酶对靶 的作用.本文也讨论了由3个单元核酶RZ1, RZ3和RZ4构成的两个三价核酶RZ134和 RZ413在体外对3个相应TMV底物RNA的切 割情况.与双价核酶相似,三价核酶也能专一地 分别切割底物B(+),B(一)和BT4(一).3 个单元核酶在两个三价核酶中处在不同的相对位 置,但对其专一作用效率并没有很大影响.对 RZ1而言,即使是处在中间,也没有因可能受到 两端的两个单元核酶的空间作用而影响其专一性 及作用效率. 在有多个底物存在时,核酶对底物的专一作 用效率是否会因为底物RNA形成复杂的空间结 构而受到影响?本文对这个问题作了一定的研 究.对于BT2(+),BT2(一)和BT4(一)的混合 底物,只有带有RZ4的单价,双价或三价核酶仍然 可以专一切割BT4(一);而带有RZ1和RZ3的核 酶(不论是单价,双价还是三价)对于BT2(+)和 BT2(一)的切割受到了很大的影响.这显然是底 物BT2(+)和BT2(一)两条链完全互补所致.当 被单独切割时,底物的序列可与核酶形成专一的 锤头"结构而表现出专一切割作用.然而一旦把3 个底物相混后,BT2(+)和BT2(一)两条链退火 形成了双链(或局部双链)结构,阻碍了核酶与靶 区序列的配对形成"锤头"结构.图3第4至11 列内形成的大量未被切割的大分子底物正暗示了 Fig4Cleavageof阴(一)byindividualri— bozyl~eRZ1.RZ4andtri-oomponentribo~yme RZ134andRZ413 1,BT4{一)withoutfihozynle~ 2—5,Blr4(一)reactedwithRZ1(2),Rz4(3), RZ134(4)andRTA13(5)re~eet[vely ThenumbersorAtheLeftsidethefigurerepresent thelengthsinnuc[eotideofBT4(一)andcleavage pmducts~sotlda—sindi~tetheproductscleaved byRZ4;thebarsinchoatetheproductscleaved'oy RZI;theopenBtrow$indicatetheproductscloyed bvb0thRZ1dRZ4 一^, 第l期底物和校酶的序列对棱酶作用的影响67 这种局部双链的形成.与之相反,底物BT4(一)序列与上述的两个底物不是同源,在混 合物中不能与其他两个底物形成双链,从而不影响核酶RZ4与BT4(一)靶区配对及专一 切割.许等曾针对TMV基因组RNA的3末端设计合成了一个核酶RZ2.但该核酶 在体外对其底物没有任何作用,即便是经过变性处理仍然没有作用.其中一个主要原因 可能就是TMV的3末端有一个复杂而稳定的类似tRNA的三叶草二级结构,它阻碍了 RZ2与其靶区形成"锤头"结构.这些结果提示要充分重视底物的状态对体内表达的核酶 功能的影响. 从抗病毒的整体意义上说,亦即从最大限度地破坏病毒RNA出发,多价核酶要比单 价核酶更为有效Ls,7j病毒在植物细胞内的复制过程中会形成RI或RF程度不同的双链 RNA分子,这些双链区域必然会极大地影响一些核酶在该区域的切割作用,从而降低了 核酶对病毒RNA的破坏作用.因而,单价核酶可能难以达到有效切割病毒RNA的目 的.多价核酶由于含有多个作用于不同靶序列的单元核酶,尽管当有些靶位点因为底物 形成双链或核酸蛋白复合物而使多价核酶中部分单元核酶失去作用,但仍有一些单元 核酶可有效切割暴露在外的靶位点,从而使病毒tCNA失去功能.因此多价核酶比单价 核酶有更多的机会破坏靶分子.多价核酶的设想将有助于核酶抗病毒基因工程的成功. 本文所报道的关于RZ1对BT4(一)的出人意料的切割作用,提醒应注意核酶作用 的 复杂性.这可能是由于核酶作用实际所需的底物配对区可能远小于我们设计时所给的长 度,也可能存在其他类型核酶作用方式.对这一现象有待进行更深入的研究. 参考文献 [1ZaugAJ,CechTRrheinte~enitlgsequenceRNAofTetrahymenaisane~ymeSalence,198 6,231:470475 【2jZaugAJ,B瞠nMD,ohTRTheT~trahymenanbozyme0X2tSlikeRNAct?nendonucleas~J\~ture. 1986,324:429—433 [3?selJ,GerlaehWLSimpleRNAe~yr/te$withnandhighlyspecificendoribonue]~zctivifezNa ture. 1988,334:585—591 [4]许敢皑.事洁,张庆琪:棱酶的体外合成及其对烟草花叶病毒RNA靶的作用.中国科学(B辑),1992,1:47— 53. [5]李洁,金悔翎,张庆琪等:双价棱酶对烟草花叶病毒的两个靶序列的专一切割作用.生物工鞋,1995.11 (1):289—294 6]Mat~ewsREFPlantV/relogy,3rded,SanDiego:Acede~nicPress,Inc.1991,l46 7ChenCJ,BanedeaAC,Ha肌ls.nGGetMtdtitargetril0ozymedirectedtOcleaveatuptoninegh1y…ed HIV?1RNA~gioosinhibitsHIV-1rep[ication-potent[~[effectivene~aagainstm0stp~t]y ?cedHIV1- laresNucleicm,1992.20(17):45814589 68生物化学与生物物理第29卷 InfluenceofSubstrateandRibozymeSequences ontheFunctionsofRibozyme SONGRen-Tao,LIJie,JINHai—Ling,ZHANGQing—QiandXUZheng-Kai (sKeyLd删ofPZantM,妇址crGentks,_‰InseCureofP/ant幽,ChinewAcademy 蹦,200032) ABSTRACT . Themono-componentrlbozymeRZ1,RZ3andRZ4wereligatedindifferentordersinto I%VOtri— oomponentb0zvnsRZ134andRZA13.Bothod-componentrlbozymescoulddeaveindi- vidl】丑lsDecificsubstratesequencesfromdifferentregionsofthetobaccomosaicvi九 ls(TMV) RNA.Thecleavageefficiencyandspecificityofeachunit—ribozymesinthetri— componentri— bozymestOitSsubstratewassimilartOitsmon~ribozymecounterpartWhenthethreesub— stratesweremixedandusedassubstratesforthetri—componentribozymes,onlytheactivity oftheunit—ribozymeRZ4wasclearlyobserved,theactivitiesoftheothertwounit— ribozymes weregreatlyreducedThereductionwasmainlyduetothefactthatthetWOsubstratesBT2 (+)andBT2(一)forRZ1andRZ3werecomplementaryinsequencetOeachotherand thereforeformedduplexinthetargetregions,thusmusthavestronglypreventedthetWOri— bozymesfromformingthecorrectstructuresrequiredforcleavageactivity.Inadditiontoits activityonthesu~tmteBT2(+),theribozymeRZ1WaSfoundunexpectedlytobeabletO cleaveBT4(一)specificallyintovariousuniqueprodUCKS. KEYWORDS:Ribozyme;Tri—componentribozyme;RNAstructure;Catalyticactivity