[教学研究]组织切片技术

[教学研究]组织切片技术 组织切片技术 第一章 组织制片概述 组织制片技术是观察细胞、组织的生理和病理形态变化的一种主要的方法。组织化学技术和原位杂交技术都是以组织制片为基础的。 一、制片前的准备工作 1.染色缸和标本瓶的清洗 用毛刷沾去污粉将染色缸和标本瓶里外擦洗，自来水冲洗干净备用。金属银或组织化学染色时，器皿更要彻底清洗。先去污粉洗，再洗液浸泡过夜，再自来水和蒸馏水冲洗。 洗涤液的配制:重铬酸钾 300克 浓硫酸 300毫升 蒸馏水 3000毫升 2.载玻片和盖玻片及其清洗 载玻片简称为玻片或载片，一般尺寸为76毫米×26毫米，厚度为1-1.5毫米。 盖玻片一般为正方形或长方形，厚度为0.15-0.5毫米。最常用的规格为18×18毫米、20×20毫米，还有其它规格的。 煮沸洗涤法: 新旧玻片均可采用。洗衣粉水浸没玻片，加热煮沸15-20分钟，冷却，自来水冲洗，干净的白棉布或纱布擦干，保存备用。 酒精浸泡擦拭:新的玻片或载片可直接用酒精浸泡、擦拭，保存备用。 洗液浸泡法:要求严格的玻片，可在洗液浸泡后在冲洗干净。 二、制片方法的种类 (一)非切片法 不用切片机、没有切片手续而制成切片的方法。常用的有以下几种: 1.整体封藏法 待制作的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 一般很小或为一薄片状，如无脊椎动物的水螅和草履虫等，脊椎动物的鸡胚和蛙胚等。这些材料取下后经固定、脱水和染色就可以封藏在玻片内。 2.涂片法 主要是液体或半流动性的材料，如血液、精液、细胞学检查、微生物等，直接将材料涂在玻片上，再经固定和染色制成标本。 血液涂片的制作与染色:取一干净载玻片，用左手拇指和食指夹住，然后取一小滴动物血置于载玻片右端,再取另一张边缘光滑的载玻片, 斜置于血滴左侧, 先向右稍移动轻轻触及血滴,使血液沿玻片端展开成线状, 两玻片的角度以30~40?为宜(角度过大血膜较厚,角度小则血膜薄), 轻轻将载玻片向左推进,即涂成血液薄膜,推进时速度要一致,否则血膜成波浪形,厚薄不匀. 待涂片在空气中完全干燥后,将血涂片靠近中央部分的两边(与载玻片短边平行的边)用玻璃铅笔圈上并平放在染色架上进行染色。?滴加数滴瑞特氏-姬姆萨(Wright’s-Giemse)混合染液覆盖已圈血膜，同时记住滴数，染3-5分钟。?滴加等量的蒸馏水后稍加晃动玻片继续染色5-10分钟。?用蒸馏水或自来水冲去染液(注意还要直接冲洗已圈部位), 吸水纸吸干或凉干即可观察。 3.撕片法 疏松结缔组织和肠系膜等就是采用这种方法。 4.磨片法 主要用于含钙盐较多的坚硬的材料，如脊椎动物的牙齿和骨。 5.撕碎法 6.压碎法 7.印片或触片法 (二)切片法 使用切片机切片而制成切片的方法。常用的有以下几种:.石蜡切片法、冰冻切片法、振动切片法、超薄切片法 第二章 石蜡切片技术 第一节 取材和固定 制作切片的第一步就是把动物杀死，取下需要制作切片的材料。动物杀死的方法很多。根据动物的大小、种类及观察目的而定。例如，青蛙和小鼠等较小的动物可用断头法。一些较大的动物如兔子和猫等可用空气栓塞法，从耳静脉注射入空气，使动物心脏发生急性空气栓塞，循环障碍，痉挛而死。此种方法各脏器易瘀血。也可采用扑杀法。无论那种方法都应该使动物迅速死亡。 动物杀死后立即取材和固定，否则组织会因失水变形和发生死后变化。 一、取材 1.动物屠宰前应写好程序，准备好刀子、剪子、镊子、线、注射器、生理盐水、固定液等。固定液的量一般为材料的10---15倍或稍多。 2.取材注意事项 取材的刀、剪要锋利;动作要轻，不可来回切割，不要挤压组织以免损伤内部，先用镊子轻轻夹住，再用剪子或刀子切下，被镊子夹过的部分不要;柔软的组织可取稍大些，固定数小时后再切成小的组织块，继续固定;取材要快;切取的材料应根据需要观察的部位进行选择，考虑好切面的方向。 3.取材的顺序 先取容易自溶的组织，骨骼和肌肉后取，依次为心脏、肺、肝、脾、肾、小、大肠、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、脑垂体等。 取肠时可用生理盐水轻轻冲洗肠内容物，然后结扎一端，注入固定液，再结扎另一端，固定3—4小时后再切成小段。肺脏可用少量固定液自气管或支气管注入，约20分钟后略膨胀再切成薄片固定。 4.取材的大小 取材的大小一般为0.5×0.5×0.3厘米，1×1×0.3厘米，最厚不超过0.5厘米。 取材很关键，应新鲜、迅速。 二、固定 将取下的材料，立即投入固定剂内，借助药品的作用，使组织细胞的形态结构保存起来。 (一)固定的目的 1.防止组织的溶解和腐败。 2.使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶类等各种物质沉淀下来，保存组织细胞原有的结构。 3.固定剂兼有硬化作用，使组织硬化、增加硬度，使组织不易变形，有利于以后的处理。 (二)固定剂的种类 种类很多，一般分为单纯固定剂和混合固定剂。单纯固定剂是用一种药品作为固定剂的如乙醇、甲醛等，混合固定剂是用几种药品配合起来，可以使各自的优点相互补充。 1.单纯固定剂 1)乙醇---无色的液体，可以与水以任何比例混合。具有以下特点: 穿透速度快，与其他固定液混合使用时可以增加他们的穿透力。 酒精固定的组织硬化显著，体积收缩厉害，组织在高浓度酒精中滞留过久，会变脆，体积缩小原体积的20%左 右。通常用95%或100% 的酒精固定，但是不宜放置过久，一般保存在70%酒精。 酒精是一种还原剂，易被氧化成乙醛，再变为醋酸，所以不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合。 酒精可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前二者生成的沉淀不溶于水，后者所生的沉淀则溶于水，所以酒精固定 的标本对核的染色不良。 2)甲醛---是一种气体，一般市售的为37-40%的甲醛水溶液或者称福尔马林，易挥发，有强烈的刺激性气味。 福尔马林固定组织，渗透力强，组织收缩少，但经酒精脱水时收缩很大，它能使组织硬化并增加组织的弹性。 甲醛为非沉淀性固定剂，但是可与蛋白质化和，对脂肪、神经及髓鞘的固定效果较好，也可固定高尔基复 合体和线粒体，为一般病理制片常用。固定后，核的染色较好，胞浆染色较差。 适合固定的浓度:10%的福尔马林。固定小块组织数小时即可，时间长也没有关系。加热可缩短固定时间。对 于较长时间固定的组织须流水冲洗24小时甚至48小时，否则会影响染色效果。因为福尔马林防止久，能 产生三聚甲醛白色沉淀，在高温下可变回甲醛，甲醛易氧化，变成乙酸，使溶液变为酸性，增加标本的酸 性，严重时影响核的染色。可用如下方法保持中性甲醛: 福尔马林 100毫升， 蒸馏水 900毫升， 一水磷酸二氢钠 4克， 磷酸氢二钠 6.5克 3)醋酸---17?以下结冰，又称冰醋酸。此液能凝固细胞核中的蛋白质，适合染色质或染色体的固定，穿透力强，对于一般的组织块，只需固定1小时。 此液可使细胞膨胀，防止收缩;不能凝固细胞中的蛋白质，所以不会使组织硬化，常和酒精、福尔马林等 容易引起组织变硬和收缩的液体混合。 4)苦味酸---是一种黄色结晶，在水中的溶解度为0.9-1.2%，在空气中能自燃，在封闭容器中能剧烈爆炸，故在实验室中常配成饱和水溶液保存。易溶于酒精、二甲苯、苯、水。 苦味酸可沉淀一切蛋白质，它对类脂物、碳水化合物无作用。此固定液对细胞收缩明显，收缩程度可达50%以上，但是不使组织变硬;穿透速度慢。经苦味酸固定的组织不用水洗，可直接用70%的酒精洗去黄色，即使留些颜色也无妨碍。固定时间不宜过久，否则影响苏木精碱性染料的染色。 2.混合固定剂 1)Bouin氏液: 苦味酸饱和水溶液 75毫升 福尔马林 25毫升 冰醋酸 5毫升。 是一种良好的固定剂，一般组织学和胚胎学的材料均可固定，该液渗透力强，固定均匀，组织收缩少，可把一般的微细结构显示出来。一般组织固定12-24小时，小块组织数小时。 2)Carnoy氏液: 纯酒精 60毫升 冰醋酸 10毫升 氯仿 30毫升。 此液穿透速度快，达快组织不超过3-4小时，小块组织20-40分钟，时间久了，会使组织膨胀并有硬化现象。多用于细胞学制片，固定染色体、中心体、有丝分裂相等;对外膜致密的组织特别适合，也适于腺体和淋巴组织。 第二节 洗涤和脱水 一、洗涤 材料从固定液中取出后，需要立即冲洗使其中含有的固定液全部除去。否则留在组织中的固定液，有的可妨碍染色，有的可以发生沉淀物或结晶影响观察，有的可继续发生作用，使材料变坏或使以后的处理发生困难。冲洗有一定的原则，视固定剂的种类而异: 1.含有苦味酸的固定液，如Bouin氏液，倒去固定液入70%的酒精更换数次即可脱水。如想除去苦味酸的黄色，可在70%的酒精中加入少量的氨水(数滴)，且能中和苦味酸，更换数次新液。 2.福尔马林固定的组织，一般不需要冲洗，固定时间长久的标本一定要充分水洗，否则会影响染色，一般自来水冲洗12-24小时。 3.含有铬酸、重铬酸钾的固定剂，必须流水冲洗，冲洗时间与固定时间相同或多于固定时间。 4.如固定液中含有氯化汞，应根据溶液的性质用水或酒精冲洗，冲洗后必须在70%的酒精中加碘去汞(一般为0.5%的碘酒精)，去汞后再用5%的硫代硫酸钠去除碘的黄色。因为汞易在组织内形成结晶不利于切片，不利于观察。 5.锇酸及含有锇算的固定液，必须用流水冲洗。因为锇算能使组织发黑，影响染色，经过酒精时形成沉淀。 6.用酒精或酒精混合液固定的组织，一般不要求冲洗，若冲洗，酒精浓度应与固定液酒精浓度相同，不可用水冲洗。 二、脱水 (一)脱水的目的和重要性 组织冲洗完毕后进一步就是脱水。因为组织经固定和洗涤后含有多量水分，因为水分不能和石蜡或火棉胶等支持剂混合，组织内有极少量的水分存在，就会妨碍这些支持剂的渗入，所以必须把组织中的水分彻底去除，这一步骤称为脱水。 脱水的作用:有利于组织的透明和透蜡。因为透明剂(二甲苯、氯仿)必须在组织完全无水的情况下才能渗入;水不能与包埋剂混合。脱水有利于组织的永久保存，水的存在能使组织分解。这是制片中相当重要的一个步骤，如果这一步骤没有掌握好，脱水不彻底，就会影响到组织的透明和透蜡，即使包埋好的材料也切不出好的切片，浪费材料和时间。 (二)脱水剂和方法 脱水剂必须在任何比例下与水都能混合，主要有两种类型: 1.非石蜡溶剂的脱水剂 如酒精、丙酮等，组织在脱水后必须经二甲苯透明才可浸蜡。 1)乙醇---常用的脱水剂，价格低廉，方法容易掌握。但是能收缩和硬化组织，还必须透明后才能透蜡。 脱水方法:一般组织可从70%酒精开始，经过80% 、90%、95%、100%酒精，使其逐步脱水。对一些柔软的组织如胚胎需 从20% 、30%或50%开始，否则组织收缩较大。 脱水的时间根据组织块的种类、体积大小而定。高浓度酒精一般不超过2小时，最长不超过3-4小时。 脱水必须干净，在换入高一级的酒精时，要先在吸水纸上吸干以免把水分带入高一级的酒精中，夹持组织动作要轻，不要损坏组织。 2)丙酮---可代替酒精做脱水剂，作用和酒精相似。脱水能力比酒精强，但组织收缩较大，多用于快速脱水或固定兼有脱水的方法中。 2.脱水兼石蜡溶剂的脱水剂 如正丁醇、叔丁醇等，组织在脱水后可直接透蜡，不需要中间二甲苯透明的步骤。 1).正丁醇---黄色液体，易挥发，吸入后发生头痛，脱水能力弱，但收缩小，可与水和酒精混合，能溶解石蜡，可不经过透明直接浸蜡。 脱水程序是:经过各级酒精，换入正丁醇，在换一次新正丁醇，最后入正丁醇石蜡中。 2)叔丁醇---无毒，可与水、酒精、二甲苯混合，是一种很好的脱水剂，此液不会使组织收缩或变硬，不必经过透明，直接浸蜡。 第三节 透明 组织在脱水后，所用的大多数脱水剂不能和石蜡相混合，透明剂既可以与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，起到桥梁的作用。它可以提出脱水剂，在代替脱水剂后导致石蜡的渗入。 当组织中全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明。如果组织不能透明， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明脱水未尽，必须重新返工，否则影响透蜡的进行。 在制片过程中，有两次透明。第一次是脱水后、透蜡前组织块的透明，目的是便于透蜡包埋。 第二次透明是染色后切片的透明，目的是利于光线的透过便于显微镜的观察。 常用的透明剂 最常用的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油、石炭酸等。 二甲苯---应用最广的一种透明剂，价格便宜。五色透明，易挥发，易溶于酒精又能溶解石蜡，能与封片剂树胶 混合，不能与水混合。透明力强，作用较快，缺点是容易使组织收缩变硬变脆。所以组织不能在内停留过 久，而且必须在完全脱水后才能应用。通常在制片进入二甲苯以前先经过1:1的酒精和二甲苯混合液，避 免材料收缩。 氯仿---组织在其中浸存较久，收缩不厉害，也不会变脆;极易挥发，在透蜡时，浸入材料中的氯仿比二甲苯容 易挥发。缺点是渗透力弱，透明时间是二甲苯的2-3倍。 苯---近似二甲苯，挥发较快。对组织收缩较少，久浸组织也不会产生变硬变脆现象。 第四节 透入和包埋 组织经过脱水、透明后要让石蜡等支持剂透入内部使组织变硬并将组织包埋进去，以利于切片和观察，这个过程称为透入和包埋。 目的是除去组织中的透明剂，使石蜡渗入组织内部后把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片。 一、石蜡的透入 石蜡是从石油中分离出来的一种甲烷系固体碳化氢。根据熔点的不同有软蜡和硬蜡之分。软蜡熔点低，一般切片所用的软蜡熔点为42-45 ?、45-50 ?。硬蜡熔点高，切片所用硬蜡熔点为52-54?或56-60?。选用石蜡的熔点应根据切片时的室温条件和组织类型来考虑。一般，石蜡硬度与组织硬度相近，组织较硬时用硬的石蜡;室温高时用硬蜡，室温低时用软蜡。石蜡太硬，切片容易切碎，石蜡太软，蜡带容易皱缩，很难展平。 配制和使用新蜡时必须经久煮练，因为新蜡内往往含有气体或水分，需要加热再溶化，反复加热以除去蜡内气体，增加石蜡密度。用过的废蜡 加热过滤后仍可使用，比新蜡更好用。 透入过程:当组织块在透明剂中透明好以后，就让石蜡渗入组织内部。先将组织块放入石蜡和二甲苯的等量混合液中，这样可减少组织的收缩和扭转，使石蜡随着透明剂渗入到组织的每个部分。从石蜡与二甲苯的混合液中取出组织块，必须经过纯石蜡?、纯石蜡?和纯石蜡?，在每个蜡中的时间一般为半小时左右。根据蜡块的大小可适当变化时间，使石蜡中含有的剩余透明剂完全去除，以免影响切片。 二 、石蜡包埋 准备好石蜡包埋框或包埋盒、冷水、镊子等。 第五节 切片、贴片和烤片 一、切片 石蜡切片机 一次性刀片 磨刀 修快、粘在木块上，准备好毛笔、成蜡带的硬纸板，光滑面是反面应朝下放，有皱纹面是正面朝上。 切片中可能出现的各种问题: 1 切片分离不能形成蜡带:室温过低或石蜡过硬，蜡边过小或不平。 2 蜡带弯曲:蜡块上下面不平行，刀钝、蜡块不与刀刃平行等。 3 蜡片上卷，切过刀口致破裂:刀口太钝或不清洁，刀的角度过大或石蜡过硬。 4 蜡片易粘在切片刀上或切片太皱:室温太高或石蜡太软;刀片角度过小也能使切片皱缩。 5 切片厚薄不一; 刀或蜡块未固定紧，切片机磨损或有故障。 6 切片出现裂隙或碎裂:组织浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在透明剂中时间过久，组织已经发脆，无法补救。 7 切片出现纵口:刀有缺口或石蜡内有硬的物质、刀口不清洁等。 8 切片时有沙沙声，切片有小孔:组织在透蜡时温度过高，组织受损，无法补救。 9 切成之片，组织自动脱落或与石蜡分离:透蜡不足。 二、贴片与烤片 1 展片---温水捞取法 展片烤片机或简易的方法，以器皿成温水，约40?左右，将预先割开的蜡片摊于水面上，蜡片受热自然张开浮游在水面上。把玻片伸入水中将已经展开的蜡片移致玻片上，拨正位置，37?烤干，约6-12小时即可染色。 2 捞片前玻片的处理---粘片剂 蛋白甘油、铬明矾-明胶、市售的各种粘片剂等 第六节 染色 根据不同的目的，选取不同的染色方法，如组织化学方法、免疫组织化学方法、细胞组织的特殊染色方法等。介绍最常用的苏木精-伊红染色法 染色步骤 1.脱蜡: 把已经干燥的切片放入二甲苯中约10-15分钟。可以脱蜡2次，各5-10分钟。 2.入1/2二甲苯与1/2纯酒精的混合液中3-5分钟。此步骤可省略。 3.依次入不同浓度的酒精复水。100% 2分钟、95% 1-2分钟、80%1-2分钟、70% 4.入蒸馏水1-3分钟。 5.入苏木精染色10-15分钟。 6.入自来水中使颜色发蓝或流水冲洗5分钟或更长，流水不能过大。 7.蒸馏水洗1分钟 8.入酸性水分化 0.5%的盐酸酒精(70%酒精)。几秒或几十秒，为染色成败的关键。 9.蒸馏水洗1分钟 10.入碱性水复蓝3-5分钟。核呈蓝色，其他结构无色。 11.蒸馏水洗1分钟 12.脱水。70%、80% 、90%酒精各1-2分钟。 13. 95%的伊红酒精溶液5-10分钟 14.95%酒精去除多余的颜色，1分钟;100%酒精两次，各3-5分钟。 15.二甲苯酒精混合液，纯二甲苯两次各5-10分钟。 16.树胶封片。 组织切片程序时间表 取材、固定 12-24小时 水洗(可省略) 12-24小时 脱水 70%酒精 2小时或稍长 80%酒精 2小时或稍长 90%酒精 2小时 95%酒精 2小时 100%酒精 1小时 100%酒精 1小时 等比例二甲苯和酒精(可省略) 0.5小时 透明 二甲苯2次 各10-20分钟 透蜡2次 各20-30分钟 包埋 切片 贴片和烤片 染色