灵芝琼脂固体菌种超声均质效果及其发酵工艺

灵芝琼脂固体菌种超声均质效果及其发酵工艺野生灵芝资源极其稀少，人工代料栽培是目前灵芝生产的主要方法，但其栽培周期长，且不同批次产品的活性成分及其含量有较大差异，不利于灵芝产品的标准化生产、应用、推广。不同于前者，灵芝液体发酵具有周期短、过程易控制、生产自动化水平高等优点，且发酵组分活性与子实体相近[4-8]，因此研究人员以生物量、多糖、三萜为目标对发酵培养基、真菌激发子、中药提取物强化活性物质生物合成等进行研究[9-12]。液体发酵是当前食药用菌研究的热点，其琼脂平板培养物常作为液体发酵或液体菌种生产的接种物[14-15]，其优点在于可缩短菌种制备时间，但发酵周期长。Xing等采用小型搅拌机均质化灰树花（Grifolafrondosa）琼脂平板培养物，作为漆酶液体发酵接种物。灵芝液体培养菌种接种前，也常采用搅拌机均质后再用于接种。研究灵芝琼脂固体菌种超声破碎效果，并优化其作为接种物的发酵工艺，为均一性菌种制备及其发酵提供参考。材料与方法材料供试菌株赤芝购自中国科学院微生物研究所，编号为CCMCC5.535。1.1.2培养基PDA培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、去离子水1000mL,于121C下灭菌20min。液体发酵培养基：葡萄糖35.0g、蛋白胨4.0g、酵母粉4.0g、KH2PO41.0g、MgSO40.5g、维生素B10.01g、去离子水1000mL，于121C下灭菌20min。1.1.3主要仪器JY-96IIN型超声波细胞破碎仪（浙江宁波新芝生物科技股份有限公司），UV5800-PC型紫外可见分光光度仪（上海元析分析仪器有限公司），NRY-2102C型恒温摇床（上海南荣实验室仪器有限公司），PHS-3C型精密pH值计（上海仪电科学仪器股份有限公司），DM750型显微镜（配LEICA*****型相机，LEICA公司）。1.2方法1.2.1菌种活化及平板培养将4C冷箱保藏的斜面菌种转至新配制的PDA斜面，于25C下活化培养7d,活化菌种接至PDA平板培养7d。1.2.2菌种超声波破碎采用无菌打孔器（直径0.5cm）在平板菌落近边缘打孔，挑取20个琼脂块至装有20mL无菌水的50mL离心管。超声前采用75%乙醇、无菌水依次擦拭超声波细胞破碎仪变幅杆；将其浸于悬液开始超声破碎，每次10s,共6次（合计时间1min）,功率250W，形成1mL悬液的生物量约相当于1个琼脂块所含生物量，即为超声均质菌种。1.2.3显微观察吸取50□超声均质菌种至载玻片，盖上盖玻片，于10倍物镜下观察并拍照。1.2.4菌落计数吸取200口1超声均质菌种悬液至9cmPDA平板上，采用涂布棒均匀涂布，于25C下培养5d后观察计数。恒摇床发酵吸取3mL均质菌种至装有50mL发酵培养基的150mL摇瓶中，接种3个琼脂固体菌种作为对照。于30C、160r/min条件下培养10d。静置加摇床两阶段发酵吸取3mL超声均质菌种至装有50mL发酵培养基的150mL摇瓶中，于30C下静置培养1〜4d，之后于160r/min摇床培养，合计培养10d,优化其发酵；接种3个琼脂菌种作为对照,同时设琼脂块菌种恒摇床发酵。基于优化的两阶段发酵，接种量分别为1〜10mL,接种至装有50mL培养基的150mL搖瓶中,以优化超声均质菌种接种量。1.2.7发酵参数分析（1）生物量（干质量法）。将发酵液以3500r/min离心,收集菌丝并去除琼脂块培养基,上清用于pH值、胞外多糖含量、残葡萄糖含量的测定；菌丝用去离子水洗涤,离心收集,重复2次。菌丝转至60目纱布，于70C下烘干至恒质量，计算生物量。（2）残葡萄糖含量。采用3，5-二硝基水杨酸法测定发酵液的残葡萄糖含量。（3）pH值。采用数显pH计测定发酵液的pH值。（4）多糖含量。参照文献[7，18]进行测定。胞外多糖含量。吸取10mL离心发酵液上清于透析膜（分子截留量10000u）中，流动自来水透析24h以去除葡萄糖等小分子，向收集的透析液加入40mL95%乙醇，充分混合后于4C冰箱过夜。过夜沉淀液以3500r/min离心10min并弃上清，将沉淀悬于25mL1mol/LNaOH溶液，于60C下水浴1h，离心收集上清。胞内多糖：干菌丝于研钵中研碎，称取100mg至25mL1mol/LNaOH溶液，于60C下水浴1h，离心收集上清。采用苯酚-硫酸法测定2种上清液的多糖。1.2.8数据处理采用SPSS16.0软件对试验数据进行统计分析，作t检验分析，以P0.05为显著性差异。试验均重复3次，试验数据用“平均值±标准差”表示。结果与分析超声均质菌种显微观察由灵芝琼脂固体菌种超声均质显微图（图1）可知，菌种破碎完全，可看到均一性菌丝体及少量短菌丝。可见，超声波破碎是一种有效的琼脂固体菌种均质方法，可用于制备均一性菌种。此外，降低培养基琼脂含量可提高超声破碎效果并缩短超声时间。超声均质菌种菌落计数图2为琼脂固体菌种超声破碎悬液稀释后涂布平板培养菌落，菌落大小一致，每个琼脂块菌种超声后形成约186.00±11.35个菌落，此为1mL超声均质菌种发酵生长点。本试验条件（5d培养时间）下，相当数量的短菌丝片段可能未生长至可肉眼观察的菌落，因此超声均质菌种发酵生长点应高于该菌落值。超声均质菌种恒摇床发酵由超声均质菌种及琼脂块菌种恒摇床发酵结果（表1）可知，超声法破碎制备的均一菌种发酵终点生物量和胞外多糖均低于琼脂块菌种。2种菌种在葡萄糖利用方面也存在显著差异（P0.05）,由于葡萄糖主要作为碳源提供细胞生长能量、参与合成细胞组成成分、合成代谢产物，超声均质菌种低葡萄糖消耗显示其弱发酵力，这与其发酵低生物量和多糖吻合。超声均质菌种所含生长点远高于琼脂块菌种，但发酵液所形成菌球数量少甚至低于后者，很显然超声均质菌丝摇床过程发生聚集并降低其生长点，这是超声均质菌种发酵水平低的重要原因。此外，菌种超声破碎过程其细胞必然受损伤，或影响超声均质菌种发酵性能。超声均质菌种不同静置时间加摇床培养两阶段发酵由超声均质菌种和琼脂块菌种作为接种物的不同静置时间加摇床培养两阶段发酵结果（表2）可知，超声均质菌种不同静置时间加摇床发酵以静置3d、摇床培养7d的生物量和胞外多糖含量最高，分别为15.14、0.86g/L,与其恒摇床发酵生物量、胞外多糖含量9.24、0.62g/L（表1）相比分别提高63.85%38.71%可见，静置3d、摇床7d两阶段发酵是超声均质菌种优化的发酵工艺。作为对照，琼脂块菌种静置培养时间1〜3d加摇床培养两阶段发酵的生物量、胞外多糖含量均高于其恒摇床发酵（P0.05）;静置时间（1〜3d）对发酵结果无显著影响（P0.05），但静置时间为4d时生物量和胞外多糖明显下降。静置期（1〜3d）细胞可能以适应发酵环境和恢复性生长为主,即为迟滞期,细胞进入生长期后需要丰富的氧分及营养供应,而此时静置培养氧质及溶质传递有限,成为其发酵的制约因素。超声均质菌种不同接种量静置加摇床（3d/7d）两阶段发酵采用优化的静置加摇床两阶段发酵工艺（3d静置培养,7d摇床培养）对不同超声均质菌种接种量的发酵结果见表3。由表3可知,随着接种量的增大,发酵终点生物量及胞外多糖含量相应提高,于接种量为7mL（约相当于7个琼脂块菌种）时达到最高，生物量、胞外多糖含量分别为17.43、1.27g/L;进一步增大接种量，生物量、胞外多糖含量均未提高,表明该优化发酵工艺下超声均质菌种的优化接种量为7mL。讨论超声波是指频率为2X104〜2X109HZ的声波，是机械波的一种，因其超越了人类听觉的上限而被称为超声波。超声波在生物研究中的应用主要以细胞破碎[19-20]、成分辅助提取[21-23]为主。细胞破碎是利用超声波在液体中的空化作用产生密集小气泡，依靠小气泡的迅速炸裂将细胞破碎。本研究表明，超声波可有效破碎灵芝琼脂固体菌种。传统的搅拌法通过高速搅拌子产生巨大的机械剪切力将细胞破碎，相比之下，超声波法具有使用方便快捷、不易污染、安全性高等优点，且对细胞的损伤可能较小。超声探头(变幅杆)易与生物反应器集成，由此可实现均一性菌种的即时制备，减少污染发生，使高均一性和高纯度液体菌种发酵生产成为现实。本研究利用超声波破碎技术成功制备高均一性、高生长点的灵芝菌种，但其作为接种物摇床发酵的生物量和胞外多糖产率低于未破碎琼脂块菌种。主要因为超声均质菌种摇床过程菌丝发生聚集现象，降低了其发酵生长点；此外，灵芝细胞超声破碎时受到损伤，这2种不利因素制约了其发酵水平。琼脂块菌种的起始生长点较少，但摇床培养过程中其自身逐渐碎片化，且新生长菌丝于原菌种脱落为新生长点，发酵液生长点不断增多。尽管摇床发酵时琼脂块菌种的生长点少，但其发酵水平仍高于超声均质菌种。两阶段发酵工艺是一种广泛应用于工业生产及科学研究的发酵技术。根据细胞生长及目标产物生物合成条件的差异，两阶段发酵有多种不同的调控模式，以最大化目标产物的合成。例如，巴聚赖氨酸(epolylysine)两阶段pH值发酵，细胞生长期pH值控制在5.0以上，&聚賴氨酸合成期pH值控制为4.0;凝胶多糖(curdlan)两阶段细胞密度控制发酵，前期采用高密度发酵技术，凝胶多糖合成阶段采用低细胞密度；虾青素(astaxanthin)发酵生产葡萄糖浓度采用两阶段控制方式，生长期、合成期分别为20、50g/L。崔建东等研究发现，冬虫夏草多糖摇动加静置两阶段发酵，摇动培养115h后静置培养120h最优，多糖产量分别为摇动培养、静置培养的1.5、2.0倍。Fang等采用先摇动培养4d、后静置培养12d的发酵方法，灵芝菌丝灵芝酸由恒摇床发酵的0.136mg/g提高至0.319mg/g。Bigelis等采用静置培养7d、摇动培养7d的两阶段发酵工艺，使抗癌疾先导化学物Flavomannin产率提高10〜100倍。本研究针对超声均质菌种传统恒摇床过程中菌丝发生聚集的现象，采用先静置培养以避免和减轻菌丝聚集，从而维持其多发酵生长点，使发酵水平大幅提高。结论超声波破碎可有效均质化灵芝琼脂固体菌种，每个琼脂块（直径为0.5cm）菌种超声破碎可形成186.00个菌落。采用超声波破碎制备的均一性菌种，其摇床发酵生物量和胞外多糖低于传统琼脂块菌种；静置加摇床两阶段发酵以静置3d、摇床振荡培养7d为最优发酵工艺。