第四章 酶学分析技术

第四章酶学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 技术酶是生物体内活细胞合成的具有高效、特异催化作功能的蛋白质。什么是酶enzyme?目前将生物催化剂分为两类:蛋白质酶、核酶（脱氧核酶）底物(substrate,S)：被催化的物质。产物(product,P)：反应生成的物质。酶促反应：酶催化的反应。酶活力：酶所具有的催化能力。几个有关名词丙氨酸谷氨酸常见酶类丙氨酸氨基转移酶ALT或GPT乳酸脱氢酶（LDH）天冬氨酸氨基转移酶（AST或GOT）肌酸激酶（CK）5′-核苷酸酶（5′-NT)α-羟丁酸脱氢酶（α-HBD)一、酶活性定义：酶活性（enzymeactivity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ：　　或　式中v：反应速率，[P]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。二、酶活性单位（一）酶活性单位定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。表示方法：惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间）国际单位IU（µmol/min）Katal单位（mol/s）1．惯用单位：20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位ALP的金氏单位（King）氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.8210-4μmolNADH为一个卡门氏单位举例：金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。2.国际单位IU（µmol/min）定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol底物转变为产物的酶量，为1U，1U=1µmol/min。IFCC,2001年37℃3．Katal单位定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的酶量。1Katal＝1mol/s。IU与Katal单位的关系：1katal=60×106U，1U=16.67nkatal（二）线性期此阶段酶促反应速率基本保持恒定；对底物而言，为反应速率与底物浓度[S]的零次方成正比的零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比；此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率。酶活性浓度越高，线性期就越短线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受的程度。线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15％，否则判为非线性特点：可代表酶促反应速度（三）非线性期（偏离线性期、平坦期）进入非线性期的原因：反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。特点：若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方成正比，为一级反应。偶联：工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类分类：第二节酶学分析的类型表7-2常用工具酶的名称及其缩写符号名称缩写符号名称缩写符号乳酸脱氢酶LDH苹果酸脱氢酶MDH6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD谷氨酸脱氢酶GLDH葡萄糖氧化酶GOD胆固醇氧化酶COD磷酸甘油氧化酶GPO过氧化物酶POD己糖激酶HK肌酸激酶CK丙酮酸激酶PK甘油激酶GK脂蛋白脂肪酶LPL胆固醇酯酶CE脲酶肌酐酶常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。工具酶的质量要求工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。NAD(P)＋或NAD(P)H偶联的脱氢酶及指示反应，NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发光波长为365nm，荧光波长为460nm，荧光法的灵敏度比分光光度法高。如ALT测定工具酶是LDH二、酶活性的测定方法测定方法分类：按照仪器 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。按照反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。按照检测对象分类：分为直接法和间接法。1、定时法原理：定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1～t2）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。特点：优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。吸光度At1t2　　时间t　　　图5-6　定时法的三种反应进程231定时法与两点法、终点法的区别2.连续监测法（continuouemonitosing）每隔一定时间（10～60s）连续测定酶反应中产物或底物的变化量称为连续监测法。又称动力法或速率法，终点法的测定两个时间点，该法进行多点连续测定。优点：多点测定结果，连接成线，很容易找到成直线的区段，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，测定结果较准确。省时、省试剂。缺点：分光光度计必须有保温装置，而且P或S应是可直接测定的化合物，如需加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响。3.平衡法（end-paintamalyin）测定酶反应开始后某一段时间内(从t1→t2)产物或底物的总变化量称为终点法。而t1和t2是反应历程中的两个点，故又称两点法。优点：简便，测定产物时，酶反应被终止，显色剂的选择只考虑对酶活性的影响，分光光度计不需保温装置。缺点：无法了解这段时间的反应是否都是零级反应，故难以保证结果的真实性。计算公式:产物的增加量每单位规定的保温时间1000（ml）酶单位/升=—————————×——————————×————————每单位规定的产物增加量实际保温时间实际标本用量（ml）分光光度法测定的公式：（A测定–A对照）·V总·106每单位规定的保温时间酶单位/升=—————————×————————·L·V标实际保温时间第三节影响酶活性测定的因素一、标本1.溶血RBC中某些酶活性比血高，如LDH高150倍，AST高15倍，ALT高7.5倍。2.抗凝剂某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA、草酸盐，可抑制需Ca2+的AMS和需Mg2+的CK、5NT、ALP等，酸酶活性测定都用血清。3.样品存放时间，各种血清酶稳定性不同，如ACP、CK在室温下迅速失活，AMS、GGT则很稳定。二、测定条件的影响1.温度温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加快。另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。（1）温度的选择37℃反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25℃、30℃可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学较难定在30℃进行，IFCC建议30℃作为参考方法的标准温度。（2）温度系数将温度每升高10℃后反应速度相当于原来的倍数，称为温度系数(Q10)。Q10表示温度对反应速度影响的大小。2.pH（1）改变底物的解离状态，影响酶与底物结合。（2）改变酶活性中心必需基因的解离状态，影响酶活性。（3）改变酶的三维空间构象，使酶变性。（4）使亚基解聚3.缓冲液性质酶活性不仅受缓冲液pH影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。（1）缓冲液中弱酸的解离数pka必须接近酶测定时的Ph。如ALT测定pH7.4（磷酸pka6.7）LDH测定pH8.8，（二乙醇胺pka8.8）ALP测定pH10（碳酸pka10.32）。（2）缓冲液对酶活性无抑制作用，如甘氨酸对LDH、ALP有抑制作用。（3）缓冲液在酶反应体系中不会发生降解或破坏。（4）缓冲液在可见光区或紫外区没有成仅有极低光吸收现象。测定酶活性时的注意事项1、规定反应条件，并使之保持恒定2、标本要新鲜3、配制的底物浓度应足够大，并加入防腐剂4、试验中器材及工具应保持清洁5、测定酶反应的时间曲线，使酶在线性反应期内进行6、正确设置对照管