第四章微生物的遗传变异第一节微生物的遗传一、遗传和变异的物质基础——DNA生物遗传的物质基础是什么?答案是DNA。亲代将各种遗传性状通过DNA传递给子代,子代获得DNA后形成一定的蛋白质,将遗传特性表现出来。什么方法最终
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了遗传的物质基础是DNA呢?1.格里菲斯经典转化实验(1928)及埃弗里、麦克劳德、麦卡蒂等人的转化补充实验(1941)。2.赫西和蔡斯大肠杆菌T2噬菌体感染大肠杆菌实验。(1952)3.植物病毒拆分重建,Fraenkel-Conrat(1956)(一)三个经典转化实验格里菲斯经典转化实验(1928)——肺炎双球菌转化实验R型菌(粗糙、无毒性)S型菌(光滑、有毒性)多糖类荚膜将R型活菌注入小鼠体内一段时间后将S型活菌注入小鼠体内一段时间后将杀死的S型菌注入小鼠体内一段时间后将R型活菌与杀死的S型菌注入小鼠体内一段时间后细菌发生转化,性状的转化可以遗传。DNA的化学结构(1)脱氧核糖碱基磷酸AGCT基本单位-脱氧核苷酸DNA的化学结构(2)A腺嘌呤脱氧核苷酸G鸟嘌呤脱氧核苷酸C胞嘧啶脱氧核苷酸T胸腺嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸的种类DNA的化学结构(3)连接ATGCATGC(二)基因基因是一切生物体内储存遗传信息的、有自我复制能力的遗传功能单位。是DNA分子上一个具有特定碱基顺序,即核苷酸顺序的片断。基因是具有固定的起点和终点的核苷酸或密码的线性序列。三、遗传物质的存在状态(一)在真核生物中的存在状态1、染色体染色体DNA的分子量真核生物大于原核生物。真核生物的染色体为线状结构。DNA和组蛋白等蛋白结合。DNA中存在大量的不编码DNA序列(如内含子)。2、染色体外的DNA——细胞器中的DNA真核微生物的染色体外的DNA主要存在细胞器中。细胞器包括叶绿体、线粒体等。其DNA分子结构与原核生物的染色体相同,为环状。具有独立的复制能力。(二)原核生物和病毒中的存在状态1、染色体DNA细菌的遗传物质双链环状DNA;无组蛋白与其相结合;与细胞膜结合;只有一个复制启始位点。病毒中则有DNA或RNA,双链或单链,线状或环状。2、质粒质粒(plasmid):一种独立于核基因组以外,具有自主复制能力的小型闭合环状dsDNA分子。(1)定义大小:1.5~300kb,仅相当于核基因组的1%,携带有数个到数十个甚至上百个基因。可以游离态形式或附加体(episome)的形式存在;(2)性质可转移性;赋于细菌特殊功能;可消除性;具有自我复制能力。(3)质粒的主要种类质粒所编码的功能致育因子(Fertilityfactor,F因子)抗性因子(Resistancefactor,R因子)Col质粒(colicinplasmid)Ti质粒(tumorinducingplasmid)代谢质粒(Metabolicplasmid)四、遗传过程共分成四个阶段1.DNA的复制细胞将某特定段DNA链进行复制。2.mRNA的转录DNA双链打开后,以单链为模板,按照碱基配对原则复制RNA。将DNA上的信息转给RNA。3.翻译由tRNA完成。通过反密码子与mRNA密码子的互补,tRNA破译氨基酸的密码,进而将所需氨基酸送到核糖体处。4.蛋白质的合成特定的碱基顺序密码送到核糖体,氨基酸按照顺序连接在一起,在酶的作用下形成多肽链,进而形成蛋白质,最终将遗传信息表达出来。基因突变(genemutation):泛指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。基因突变狭义:基因突变(点突变)广义:基因突变和染色体畸变一、基因突变第二节微生物的变异二、突变类型(一)突变株的表型选择性突变株营养缺陷型形态突变型条件致死突变型抗性突变性非选择性突变株抗原突变型产量突变型(二)突变率:一般基因的自发突变率为10-6~-9(三)突变的特性1、自发性和不对应性2、自发突变概率低3、独立性4、稳定性5、诱变性6、可逆性(一)自发突变机制背景辐射和环境因素;微生物自身有害代谢物的诱变效应,如过氧化氢;互变异构效应——酮式至烯醇式。三、基因突变的机理一对碱基被另外的一对碱基置换。转换(transition):即DNA链中的一个嘌呤被嘌呤或嘧啶被嘧啶所置换。颠换(transversion):即一个嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤所置换。(二)诱发诱变1、碱基的置换2、移码突变诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增加或缺失,从而使后面的全部遗传密码发生转录和转译错误。转座因子(transposibleelement),跳跃基因(jumpinggene)可在染色体上移动,而且还可从一个染色体跳到另一个染色体,能改变自身位置的一段DNA顺序,称为-,或跳跃基因,或可移动基因。从基因组一个位置转移到另一个位置---即转位。转位因子3、染色体畸变四、DNA的损伤及其修复嘧啶嘧啶二聚体UV1、光复活作用嘧啶二聚体嘧啶光解酶(二)切除修复(暗修复)(三)重组修复从另外相同或相似的DNA分子上取得相应的片段来修复损伤的DNA。这种修复DNA的双链要重新排列组合,所以叫重组修复。(四)SOS修复——DNA紧急修复基因。基因重组(遗传重组):指两个基因组内的遗传基因,通过一定的途径转移到一起,形成新的稳定基因组的过程。原核生物基因重组:转化、转导、接合和原生质体融合。真核生物基因重组:有性杂交.准性杂交.原生质体融合。第三节微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组(一)转化(transformation)1、概念:转化(作用)是受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。转化因子:起转化作用的供体细胞DNA片段。2、转化的特点1)转化一般只发生在同一物种或近缘物种之间。目前只在肺炎双球菌、大肠杆菌、芽抱杆菌属、嗜血菌属、假单胞杆菌属等属的某些菌种和少数真菌中发现。2)受体细胞只有处于感受态阶段才能吸收供体的DNA(即转化因子)。细菌处于感受态是因为其表面有一种吸附DNA的受体。3、转化过程:可分四步(1)供体DNA片段与受体细胞表面的膜结合,其中一条链被核酸酶水解,另一条进入细胞。(2)同源区内发生基因重组,进入受体菌的一条DNA片段寻找同源区,在同源区进行基因重组。(3)基因重组的杂合区随同受体DNA一起复制。(4)重组细胞分裂,形成一个转化子和一个仍保持受体原来基因型的子代。转化过程(二)转导(transductlo)1、概念:以温和噬菌体为载体,将供体菌的一段DNA转移入受体菌,使受体菌获得新的性状。转导现象是辛德尔(N.Zinder)和莱德贝尔格(J.Lederberg)在1952年研究鼠伤寒沙门氏菌重组时发现的。由于绝大多数细菌都有噬菌体,因而转导作用远较转化作用普遍。2、分类普遍性转导(generalizedtransduction)局限性转导(restrictedtransduction)(1)普遍性转导(generalizedtransduction)概念:通过噬菌体将供体菌任意DNA片段转移至受体菌的转导现象。普遍性转导的过程因为错误是随机的,被包装的DNA可以是供体菌染色体上的任何部分,故称为普遍性转导。(2)局限性转导概念:前噬菌体两侧的宿主染色体基因转移给受体菌的过程。(三)接合1、概念:供体菌(“雄性”)通过性菌毛与受体菌(“雌性”)直接接触,把F质粒传递给后者,使后者获得若干新遗传性状的现象。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞称为接合子。F+F-有质粒,菌毛无质粒,菌毛F+菌F–菌2、接合的特点:1)需要供体菌和受体菌的直接接触;2)是一种较为低级的有性生殖方式;3)能发生接合作用的细菌大多数是革兰氏阴性菌;如大肠杆菌及假单胞菌等。少数革兰氏阳性菌,如链霉菌属、诺卡氏菌属等也能发生接合作用。4)接合作用的雄性菌体内含有性因子F因子,因而称为雄性菌株,常用F+表示;雌性菌株缺少F因子,用F-表示。5)F因子是一种染色体外的环状DNA。二、真核微生物的基因重组(一)有性杂交(sexualhybridization)有性杂交指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组,并产生新的遗传型后代的一种育种技术。(二)准性杂交(parasexualreproduction)有一类不产生有性孢子的丝状真菌,不经过减数裂就能导致低频率基因重组并产生重组子生殖过程称为准性生殖。(三)原生质融合1、原生质融合过程2、操作步骤:(1)加标记或选择具标记亲株(2)制备原生质体选择合适的酶系*制备原生质体应注意几个问题:①菌龄②酶浓度③酶处理时间及温度④pH⑤渗透压稳定剂(3)原生质体融合助融方法:化学:PEG(聚乙二醇)物理方法:激光、高压脉冲电场电融合法的过程分为两个阶段:第一阶段是原生质体在电场的作用下,产生极化,排列成串球状,细胞间两两相互粘连;第二阶段是在高压电场力的作用下,粘连成串的原生质体的细胞膜磷脂双分子层发生微团化,使生物膜自然的融合。(4)原生质体再生(5)融合子的选择①直接法:将融合液涂布于不补充两亲株必须营养物(基础培养基)或补充有两种抗药性标记对应药物的培养基(选择培养基)上,直接筛选出杂合子。②间接法:将融合液涂布于营养丰富的再生培养基上,使未融合的和融合的都生长出来,然后用影印法接种在对应的基础培养基或选择培养基上,经过对照选出杂合子。一、诱变育种(breedingbyinducedmutation)是通过人工方法处理微生物,使之发生突变,并运用合理的筛选程序和方法,把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。(一)诱变育种的概念第四节人工构建新菌株(二)诱变育种的程序性能测定出发菌株———→菌种纯化———→制备斜面孢子或悬 活菌计数形态观察———→诱变剂处理————→平板涂布————→挑变异性能初测性能精测菌于平板培养————→斜面传代————→放大试验————→菌种保藏并用于生产分为物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三类:1、物理诱变剂:物理诱变剂包括非电离辐射的紫外线、激光和离子束,还有能引起电离辐射的x射线、γ射线、快中子、α射线、β射线和超声波等。在微生物诱变育种中前四种较常用。2、化学诱变剂:有十多种,如亚硝酸、硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)、氮芥、乙烯亚胺、5-溴尿嘧啶、吖啶黄等。对生物有“三致”作用:致突变、致畸变、致癌变。(二)诱变剂的种类(三)出发菌株的选择出发菌株即用于育种的原始菌株。选择好出发菌株,相当重要。(四)孢子(或菌体)悬浮液的制备用生理盐水或缓冲液来制备。(五)性能测定1、粗测(初筛)例如:要测定某菌是否产生蛋白酶及其活力大小,可在酪素平板上看有无透明圈及其大小。2、精测(复筛)例如:1)柠檬酸生产菌黑曲霉的选育:采用微量滴管接种,纸片培养方法,根据指示剂变色圈直径的比值进行初筛;2)蛋白酶生产菌酱油曲霉的选育:根据酪蛋白培养基上透明圈直径和菌落直径的比值进行复筛;3)头孢霉素生产菌的选育:按抑菌圈直径和菌落直径的比值进行复筛。其结果与摇瓶发酵产量一致,提高了筛选效率。二、基因工程是指基因水平下的遗传工程,将某一生物体(供体)的遗传信息在体外人工与载体相接(重组),构成重组DNA分子,然后转入另一生物(受体)细胞中,使被引进的外源DNA片段在受体内部得以表达和遗传。(一)基因工程技术的基本过程:5、筛选出带有重组DNA分子的转化细胞1、目的基因DNA片段的准备2、载体制备3、含目的基因的DNA片段与载体相连接4、将重组分子送入受体细胞并于其中受制,扩增。DNA重组技术图示:1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物;1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用;1985第一批转基因家畜(兔、猪和羊),中国转基因鱼;(二)基因工程技术的成功应用1993基因工程西红柿在美国上市;1997英国罗斯林研究所多莉羊;1999.9中国获准加入人类基因组
计划
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.负责测定人类基因组全部序列的1%;2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图;2001.2.11公布人类基因组基本信息。(一)常见的菌种退化现象:1、菌落和细胞形态改变例如某些放线菌或霉菌在斜面上多次传代后,产生“光秃”型,出现生长不齐或不产生孢子的退化。这种退化是不利于生产的。2、生产性能的下降:例如发酵菌株的发酵能力下降,代谢产物减少等,都是明显的退化。3、对生长环境的适应能力减弱:例如抗噬菌体菌株变为敏感菌株,原来能利用某种物质的能力降低等。 三、菌种的退化与保藏(二)菌种退化的原因1.有关基因的自发突变2.育种后未经很好的分离纯化3.培养条件的改变4.污染杂菌(三)防止退化的
措施
《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施
(复壮)1.控制传代次数,降低自发突变的几率;2.创造良好的培养条件;3.利用不易衰退的细胞传代;4.采用有效的保藏方法;5.经常进行分离纯化。(四)菌种的保藏1、菌种保藏的基本原理根据微生物的生理、生化特点,选用优良菌株,最好是它们的休眠体,人工地创造适合于休眠的环境条件,即干燥、低温、缺氧等,使微生物的代谢活动处于最低的状态但又不至于死亡,从而达到保藏的目的。2、菌种保藏的常用方法一种好的菌种保藏方法,首先应能长期保持菌种原有优良性状不发生变异,同时也应考虑到方法本身的简便和经济。2、菌种保藏的常用方法(1)斜面冰箱保藏法将菌种接在适当的斜面上,待其生长丰满后,可放在4℃冰箱中保藏。此法一般可保藏3个月左右。各类菌种均可用此法进行保藏。(2)半固体穿刺保藏法将菌种接入半固体直立柱中,然后进行培养。待长好后,放入4℃冰箱中保藏。此法可保藏半年左右,它适用于细菌、酵母的菌种保藏。3、石蜡油封存法将无菌石蜡油加入到上述保藏的菌种中,使菌种与空气隔绝,则保藏效果更佳,一般可保藏三年左右。根据同样的道理,用灭菌的橡皮塞代替原来的棉花塞,效果也是好的。4.砂土管保藏法取过筛(60目)河砂,用10%盐酸浸泡、用水洗净后,烘干。再取瘦土,以4:1量混合,装入小试管、灭菌后,滴入几滴菌种悬液,用接种针搅匀。然后放入干燥器中,抽气干燥,放入低温处保藏。此法一般可保藏1至数年。它适用于产生孢子的微生物的保藏。5.冷冻干燥保藏法将用灭菌牛奶做成的高浓度的菌液装入灭菌的安瓿瓶中,放在低温条件下抽气干燥,使其中的水分因升华作用逸出,而形成完全干燥的菌块,然后将安瓿瓶在真空条件下融封。这种方法因菌体内的水分全部被抽掉,无法进行任何代谢作用,所以保藏期很长。一般可在5年以上。它适用于各大类微生物的保藏。原理:液氮的温度可达-196℃,远远低于新陈代谢作用的停止温度(-130℃)。操作方法及步骤:1)选择安培管:2)保护剂:常用的保护剂是10%的甘油,用保护剂制成菌液,装入安培管的量为0.2-1mL。3)冻结:液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温,这样细胞在接触低温前,使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。美国的ATCC采用先将菌液降温到0℃,再以每分钟1℃的速度一直降低到-35℃,然后才在液氮管中降温,由于液氮容易挥发,使温度上升,冰晶状态发生变化,从而导致菌体死亡,所以要注意定期补加液氮。4)重新培养:在重新培养之前,要先将安培管从冰箱中取出,在35-40℃水浴中迅速解冻,当安培管温度生至0℃时即可打开安培管。将菌种移至适宜的培养基上培养。6、液氮超低温保藏法3、保藏机构(1)国内:中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)中国培养物保藏中心(CCTCC)(2)国外:美国典型培养物保藏中心(ATCC)荷兰霉菌中心保藏所(CBS)英国国家典型菌种保藏所(NCTC)日本大板发酵研究所(IFO)多利羊之父威尔穆特多利羊成为明星多利和它的孩子