毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选

Pichia酵母 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达直接PCR1.平板上的菌落长到肉眼可见时〔约12小时〕；2.取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了3.将除了模板之外的其它PCR反响液的组分准备好，并分装。3.用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR扩增，利用5’AOX1和3’AOX1引物对转化子进行PCR复筛,同时 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichiapastoris基因组，那么会扩增到两条带，一条为2.2kb〔KM71为3.6kb〕宿主茵AOXI基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor)Each50µlaliquotofcompetentPichiacellswith3µglinearizedplasmidDNAwillyield50coloniesonselectivemedium.Muts表型重组酵母的诱导表达实验Asageneralrulewheninducingexpression,neverallowculturestobemorethan10-30%ofyourtotalflaskvolume.1.挑选一单菌落，置于装有50mlMGY、BMG或BMGY培养基的500ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(~16-18h)；2.室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM,BMM或BMMY重悬菌体〔约2.5~5ml〕；3.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体， 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间。时间点一般取：0、24、48、72、96和120h；6.对分泌表达，别离样品的上清液；对胞内表达，别离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。Mut+表型重组酵母的诱导表达实验1.挑选一单菌落，置于装有25mlMGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(~16-18h)；2.室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右〔约100~200ml〕；3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；6.对分泌表达，别离样品的上清液；对胞内表达，别离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。BMGY和BMMY的换液方式有2种：1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。2）另一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。用新开启的分析纯甲醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取参加摇瓶就可以了。也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，参加1/10-瓶很难摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。Mut+/Muts的筛选用SacI，SalIorStuI线性化插入HIS4位点的载体转化GS155后，多数转化子应为Mut+，但也有His+Muts的转化子存在〔见Invitrogenprotocolp36〕，NotIorBglII线性化插入AOXI位点的载体转化GS155后，用MD/MM平板可区分Mut+/Muts。UsetheplatescontainingtheHis+transformantsandscreenfortheMut+andMutSphenotypeasdescribedbelow.1.Usingasteriletoothpick,pickonecolonyandstreakorpatchoneHis+transformantinaregularpatternonbothanMMplateandanMDplate,makingsuretopatchtheMMplatefirst.2.Useanewtoothpickforeachtransformantandcontinueuntil100transformantshavebeenpatched(2-3plates).3.TodifferentiateMut+fromMutS,makeonepatchforeachofthecontrols(GS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β-gal)ontotheMDandMMplates.4.Incubatetheplatesat30°Cfor2days.5.After2daysorlongerat30°C,scoretheplates.Mut+transformantswillgrowwellonbothMDandMMplates.MutStransformantswillgrowwellonMDplates,butshowlittleornogrowthontheMMplates.WerecommendpurifyingyourHis+transformantstoensureisolationofapureclonalisolates.YoumaydothisbeforeoraftertestingfortheMutphenotype.Replica-PlatingProcedureThisproceduregivesalowerrateofmisclassifications,butitincreasestheoverallMut+/MutSscreeningprocedureby2days.Youwillneedequipmenttoreplica-plate.1.Usingsteriletoothpicks,patch100His+transformantonMDplates(2-3plates).Forcontrols,makeonepatchfromeachofthestrainsGS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β-galontotheMDplates.2.Incubatetheplatesat28-30°Cfor2days.3.After2days,replica-platethepatchesfromtheMDplatesontofreshMMandMDplatestoscreenforMutStransformants.4.Incubatethereplicaplatesat28-30°Cfor2days.5.After2daysat28-30°C,scorethereplicaplates.LookforpatchesthatgrownormallyontheMDreplicaplatesbutshowlittleornogrowthontheMMreplicaplates.IncludingHis+Mut+andHis+MutScontrolpatchesoneachplatewillprovideexamplesofMut+andMutSphenotypes.ScreeningbyFunctionalAssaySomeresearchershaveusedafunctionalassaytodirectlyscreenforhighexpressingPichiarecombinantcloneswithoutfirstscreeningforMutSorMut+phenotypes.Ifyouelecttoscreendirectlyforhigh-expressingrecombinants,besuretoalsochecktheMutphenotype.Thiswillhelpyouoptimizeexpressionofyourrecombinantclone.毕赤⑴接种重组和空质粒转化子于5mlYPD+k抗生素培养基，GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。⑵室温下，1500g离心5-10min收集菌体⑶100ulTE〔pH7.0〕重悬，参加300ulEDTA〔pH8.0〕，0.07MTris－HCl，3ulβ-巯基乙醇，1ulLyticase，37℃水浴30min。⑷10000g离心5~10min，取沉淀，加90ulTE重悬。⑸200ul饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s，取上层水相。⑹参加两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC，-20℃放置30min；⑺10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；⑻枯燥后，参加15μl的TE或H2O溶解，-20℃备用。重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。所以一定要保存好最原始的重组菌株，每次从中划板，挑单克隆高表达菌株。Pichia菌落PCR〔史飞〕：30ul培养液，0.2%SDSVotex15sec离心1min取上清，稀释5-10倍用于PCR模板GS115接种GS115于5mlYPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48小时，用YNB根本培养基和含His的补充培养基作点种别离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在根本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。GS115的his4基因突变了，不能在组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了，而YNB却只含根本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB上不长的是GS115，这样能挑到纯的，以防突变毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制10*YNB〔含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母根底氮源培养基〕4℃保存。34g酵母根底氮源培养基〔无硫酸铵〕+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌，或134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过虑除菌or115℃15-20min灭菌。注意毕赤酵母在高浓度YNB下生长更好，所用YNB的量是酿酒酵母中的两倍。500*B〔0.02%生物素Biotin〕20mg的生物素溶于100ml水中，水浴加热溶解，温度不能高于50度。过滤除菌。4℃保存保存期为1年。D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNBMD、MM属于根底培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子〔如生物素〕，所以肯定要加的。100*H〔0.4%Histidine组氨酸〕4℃保存保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，〔加热至50℃以促进溶解〕，过滤除菌。10*D〔20%Dextrose葡萄糖〕保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，115℃灭菌15-20min或过滤除菌。10*M〔5%Methanol甲醇〕保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。10*GY〔10%Glycerol甘油〕保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。100*AA〔0.5%ofeachAminoAcid，各种氨基酸〕4℃保存保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。磷酸钾溶液〔，〕，将的溶液1MpotassiumphosphatebufferpH6.01mol/LK2HPO4132ml与的溶液混匀，其为，如需调节，那么使用磷酸和氢氧1mol/LKH2PO4868mlpH6.0pH化钾调节pH。1M山梨醇毕赤酵母表达的培养基配制2.1LB〔Luria－Bertani〕培养基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCll％PH7.0制作平板时参加2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。2.2LLB〔LowSaltLB〕培养基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCl0.5％PH7.0制作平板时参加2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。2.3YPD完全培养基〔又称YEPD〕〔YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基〕Yeastextract1%10g/LTrypton2%20g/Ldextrose(Dglucose)2%20g/L+agar2%20g/L液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。YPD或YEPD：YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1L)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，参加琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基.YPD1.溶解10gYeastExtract(酵母膏),20gPeptone(蛋白胨)于900ml水中，如制平板加20g琼脂粉2.高压121度20min3.参加100ml20%〔10X，共20g〕的Dextrose(glucose)(葡萄糖)，(葡糖糖溶液灭菌后参加)注：葡萄糖，yeastextract,peptone溶液混合后在高温下可能会发生化学反响，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。葡萄糖可以过滤除菌，也可以115℃15-20min灭菌。YPD培养基用途：用于酵母菌的培养，及供药品和生物制品含王浆和蜂蜜的合剂酵母菌数测定。YPEG：除了用3%乙醇和3%甘油代替葡萄糖作为碳源外，其他成分同YPD;YPDZ是在YPD的根底上加上ZEOCIN抗生素;YPDA是在YPD的根底上加0.003%的腺嘌呤硫酸盐。2.4MD与MDH选择培养基MinimalDextroseMedium+〔Histidine〕最小葡萄糖培养基+〔0.004%组氨酸〕〔含有：1.34%YNB；；4X10-5%生物素；2%葡萄糖〕1.灭菌800ml的ddwater，冷却到60℃左右，参加2ml的500*B，100ml的10*YNB100ml的10*D母液，4℃保存2.如配制MDH，可在上述的MD中参加10ml的100*H即可，4℃保存；3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，参加15g的琼脂。4℃可保存数月。2.5MM和MMH培养基MinimalMethanolMedium+〔Histidine〕〔含有：1.34%YNB；4X10-5%生物素；0.5%甲醇〕1.灭菌800ml的ddwater，冷却到60℃左右，参加2ml的500*B，100ml的10*YNB100ml的10*M，4℃保存2.如配制MMH，可在上述的MM中参加10ml的100*H即可，4℃保存；3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，参加15g的琼脂。4℃可保存数月。MMorMD是筛选mutS和mut+表型的。2.6BMG和BMM培养基BufferedMinimalGlycerol，BufferedMinimalMethanol〔含有100mMpotassiumphosphatepH6.0,1.34%YNB；4X10-5%生物素1%glycerolor0.5%methanol〕1.灭菌700ml的ddwater，冷却到室温，参加2ml的500*B，100ml的10*YNB100ml的1Mpotassiumphosphatebuffer100ml的10*GY，4℃保存2.如配制MMH，可在上述的BMG中用100ml的10*M取代100ml的10*GY即可，4℃保存，可保存2个月。2.7BMGY和BMMYBufferedGlycerolcomplexMedium,BufferedMethanolcomplexMedium(含有1%yeastextract,2%peptone,100mMpotassiumphosphatepH6.0,1.34%YNB；4X10-5%生物素1%glycerolor0.5%methanol)1.溶解10g的yeastextract〔1%〕，20gpeptone〔2%〕在700ml的ddwater，灭菌2.冷却到室温，参加2ml的500*B，100ml的10*YNB100ml的1Mpotassiumphosphatebuffer100ml的10*GY，4℃保存3.如配制BMMY，可在上述的BMGY中用100ml的10*M取代100ml的10*GY即可，4℃保存，可保存2个月。YPD：最根本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。YEPD是不能代替BMGYYPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低本钱。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油剩余会抑制甲醇利用。BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。YouwillneedeitherBMGY/BMMY(bufferedcomplexglycerolormethanolmedium),BMG/BMM(bufferedminimalglycerolormethanolmedium)orMGY/MM(minimalglycerolorminimalmethanolmedium)forexpression.BMG,BMM,BMGY,andBMMYareusuallyusedfortheexpressionofsecretedproteins,particularlyifpHisimportantfortheactivityofyourprotein.UnlikeMGYandMM,theyareallbufferedmedia.Becausethesemediaarebufferedwithphosphatebuffer,awiderangeofpHvaluesmaybeusedtooptimizeproductionofyourprotein.BMGY/BMMYcontainyeastextractandpeptonewhichmayhelpstabilizesecretedproteinsandpreventordecreaseproteolysisofsecretedproteins.Inclusionofyeastextractandpeptoneactasa"mixedfeed"allowingbettergrowthandbiomassaccumulation.2.8YPDS培养基〔YeastExtractPeptoneDextrosesorbitolMedium酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基/山梨醇〕：山梨醇:稳定的渗透压，在电击过程中保护宿主细胞,改变细胞膜的通透性yeastextract1%peptone2%dextrose(glucose)2%sorbitol1M+agar2%不管是液体YPDS培养基，还是YPDS+G418培养基，必须存放4℃条件下，有效期1～2周。2.9MGYMinimalGlycerolMedium〔最小甘油培养基〕〔34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素〕。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。2.10MGYHMinimalGlycerolMedium+Histidine〔最小甘油培养基+0.004%组氨酸〕在1000ml的MGY培养基中参加10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。2.11RDB转化培养基(酵母原生质体转化用)RegenerationDextroseMedium〔葡萄糖再生培养基〕〔含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%AA氨基酸〕1.将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2.冷却后于45℃水浴；3.将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。2.12RDHRegenerationDextroseMedium+Histidine(酵母原生质体转化用)〔葡萄糖再生培养基+0.004%组氨酸〕在RD培养基配制的第三步中，在参加10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78mlRD相同。4℃保存。2.9RDB及RDH平板的制备(酵母原生质体转化用)1.将186g的山梨醇和15-20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、〔10ml的100*H母液〕和88〔78〕ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.迅速制备平板。4℃可保存数月。2.13RD及RDH的TOP琼脂的制备〔常用于酵母菌的包被〕(酵母原生质体转化用)1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、〔10ml的100*H母液〕和88〔78〕ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。PichiayeastculturedetailsThegrowthtemperatureofPichiapastorisis28-30°Cforliquidcultures,plates,andslants.Growthabove32°Cduringinductioncanbedetrimentaltoproteinexpressionandcanevenleadtocelldeath.Otherimportantfacts:DoublingtimeoflogphaseMut+orMutSPichiainYPDis~2hoursÏMut+andMutSstrainsdonotdifferingrowthratesunlessgrownonmethanolïDoublingtimeoflogphaseMut+Pichiainmethanolmedium(MM)is4-6hoursïDoublingtimeoflogphaseMutSPichiainMMis~18hoursïOneOD600=~5x107cells/mlNote:Growthcharacteristicsmayvarydependingontherecombinantstrain.Tostorecellsforweekstomonths,useYPDmediumorYPDagarslants(seepage55).•StreakforsinglecoloniesofGS115,KM71,oraHis+transformantonYPD.•TransferonecolonytoaYPDstabandgrowfor2daysat30°C.•ThecellscanbestoredonYPDforseveralweeksat+4°C.Tostorecellsformonthstoyears,storefrozenat-80°C.•CultureasinglecolonyofGS115,KM71,oraHis+transformantovernightinYPD.•HarvestthecellsandsuspendinYPDcontaining15%glycerolatafinalOD600of50-100(approximately2.5-5.0x109cells/ml).•Cellsarefrozeninliquidnitrogenoradryice/ethanolbathandthenstoredat-80°C.Afterlong-termstorageat+4°Cor-80°C,werecommendcheckingtheHis+transformantsforcorrectgenotypeandviability.StreakonMM,MDorMGYplatesbeforeusingagain.TCA培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳。表达上清很少有直接考染能看得到条带的，1ml表达上清浓缩到20ul直接电泳。一般表达量大于1mg/ml可以看到明显条带，但重复性不好。具体步骤：º0.make100%(M/V)TCA:454mlH2O/KgTCA,maintainindarkbottleat4C,Becareful,usegloves!1.菌液10000g,离心5分钟，收集表达上清。2.取500-1000ul上清于EP管中，参加1/9体积的100％TCA(Trichloroaceticacid)，颠倒10次混匀。3.样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。4.15000g,离心10－20分钟,可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去剩余在管口的液体。5.将EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱10－20分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。可以改成室温或用电吹风，关键是除去管底和管壁剩余液体。6.15000g,离心10－20分钟,用20ul枪头尽量吸去管底剩余的液体，此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀。7.EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱5分钟，确认管壁和管底没有液体残留。8.参加20－50ulLoadingbuffer，95度加热10nim，一般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用20ul枪头轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有剩余TCA。如果蓝色的Loadingbuffer不变成黄色，说明剩余TCA吸弃了或者第5步和第6步改为丙酮洗:5.参加200ul冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁剩余的TCA。6.15000g,离心10－20分钟,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去剩余在管口的液体。ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHClpH8.5toobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)样品是酵母细胞超声后离心获得的上清，用Loadingbuffer溶解蛋白沉淀，始终不能溶解，而且加热超过10分钟以后也依旧不溶解，很可能是TCA没有除干净。Typtone做TCA沉淀效果不好，沉淀很多，颜色是绿的，不好溶，Peptone沉淀是黑色的，比拟少，一般用丙酮洗一步后很好溶。胞内蛋白：反复冻融屡次，然后15000rpm离心4度即可ELISAprotocol；原位双膜法快速检测阳性表达株用BMMY培养基一般表达1－2天收集表达上清，稀释一定比例铺板做ELISA检测1.取5－10ulBMMY表达上清用0.05MNaHCO3稀释到100ul铺ELISA板，37度或室温振荡大于1小时。注意一定要做一个GS115空菌株表达上清作为阴性对照，最好还找一个带有histag的蛋白作为阳性对照。2.TPBS洗板3TPBS至满，重复。3.加封闭液〔TPBS加1％脱脂奶粉〕350ml/孔，室温下放置40分钟－1小时，TPBS洗3次。4.加封闭液稀释的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。很多公司都有histag的单抗，个人觉得Qiagen和Pharmacia单抗较好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1：1000－5000稀释，不同公司的抗体效价不同。5.加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。二抗很多公司有，国产的华美都可以，1：500－1000。如果是HRP标记的histag抗体，不加二抗直接显色。6.参加OPD显色液100ul/孔，避光反响约10－30分钟。显色液配方：1mg/mlOPD于0.1M柠檬酸钠，PH5.5，0.1%H2O2，－20度避光保存。也可以用DAB显色。7.1MH2SO4100ul/孔终止反响，酶标仪测OD490nm。TCA沉淀考染看不到条带，可以打算作ELISA，但可能上清里面杂蛋白太多，抗原〔目的蛋白〕不可能包被到板子上，所以几乎不可能检测到的。他们建议作点杂交，就是把少许上清点到PVDF膜上，以后就按照westernblot就可以了。ELISA使用多抗，意义不是很大，因为确实阴性对照也显色，和阳性结果差不了太多，特别是蛋白表达水平不高的话，两者区别很不明显，一抗是自己制备的多抗,空白值在0.2左右,阴性对照(即空白宿主自身表达的上清)OD值大约在之间,目的蛋白测的值却在0.6-0.65.可见效果还是比拟明显的.因为是多抗阴性对照难免会对结果产生影响.没有单抗也只能这样了.原位双膜法快速检测阳性表达株：1将醋酸纤维素薄膜置于MD/His-平板的His+转化子菌落上,用涂布棒轻压使醋酸纤维素薄膜完全湿润并赶尽气泡,使所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上.2在BMMY板上置一同样大小的硝酸纤维素薄膜,并将醋酸纤维素薄膜菌落向上置于硝酸纤维素薄膜上.30℃孵育18h后,将醋酸纤维素薄膜移至MDP2His平板上,4℃保存3将硝酸纤维素薄膜取下,6小牛血清%37℃封闭2h,TBS-T(Tris-NaCl缓冲液加0105%吐温20)洗3次(每次10min).加一抗室温孵育2h,TBS－T洗膜3次.然后二抗室温孵育2h,TBS2T洗膜3次.最后显色。在强弱不等的颜色中挑选染色最强的克隆，做诱导表达进一步验证。操作时，一定要记好位置，以免不能将膜上的克隆和板上的克隆对上。以后的步骤就根本上是做western，所以用硝酸纤维素膜通过虹吸将醋酸纤维素膜上的菌落分泌的液体转到硝酸膜上，相当于western的转膜过程。蛋白降解1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比拟广，4～7都可以试一下；2pcr突变酶切位点〔当然不能影响表达和蛋白活性〕。1〕、Thefirstisaddingtotheculturemediumofamino-acidrichsupplementsuchaspeptoneorcasaminoacid,whichreduceproductdegradationpossiblybyactingasexecesssubstratesforoneormoreproblemproteases.2〕、ThesecondstrategytominimizeproteolyticdegradationistooptimizetheculturepHbetweenpH3.0andpH7.0.3〕、Thethirdstrategyinvolveselevatingthelevelofammoniumintheculturebrothadequately,whichisexplainedbythehypothesisthatporteaseactivityisinducedundernitrogenstarvation.Theforthstrategyislettheculturetemperature28deginsteadof30deg.