牛的精液冷冻*第1页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四实验目的了解牛的精液冷冻保存的基本操作和流程初步掌握牛的精液冷冻和解冻的基本方法*第2页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四实验原理利用-196℃的液氮、-79℃的干冰等冷源，将精子经过降温冷冻处理来降低或抑制精子新陈代谢程度从而达到延长精子在体外生存时间，升温后又恢复活性完成受精的目的。*第3页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四精子冷冻损伤物理性损伤化学性损伤氧化性损伤*第4页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四实验原理按冻精剂型：主要为颗粒冻精和细管冻精两种细管型冻精的优点是标识、分装、冻结都可以采用机械设备进行，且解冻后效果好于其他剂型，运输使用方便，易识别，不易污染。用细管冻精对母牛进行人工授精时，其受胎率较用颗粒冻精高，效果好。但是颗粒冻精制作成本低，目前国内部分地区仍在使用。*第5页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四实验材料和仪器牛的精液样品液氮罐、铝饭盒、烧杯、冰箱、试管、水浴箱、低温温度计、显微镜、盖玻片、载玻片*第6页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四实验内容1、冷冻稀释液的配制12%蔗糖液75mL、卵黄20mL、甘油5mL、青霉素1000IU/mL、链霉素1000IU/mL第7页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四蔗糖能溶于水，但不能进入精子细胞，因此在冷冻过程中它能使细胞外保持在一个高渗透压水平，引起水分外渗，导致精子皱缩，避免了冰晶的形成，从而有效的保护了精子细胞免受冷冻损伤。糖类可减少甘油对精子细胞的毒害作用，提高精子的活率和顶体完整率。卵黄能为精子细胞提供能量，保证了精子正常的生理功能，还具有渗透性缓冲剂的功效，使精子在低渗和高渗状态下维持活率，它的使用能起到有效保护精子冷冻效果的作用。在稀释液中添加抗冻物质甘油，以增强精子抗冻能力，对防止冰晶的发生有重要作用。*第8页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四实验内容2、解冻液的配制柠檬酸钠2.9g、蒸馏水100mL*第9页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四正常牛精液呈弱碱性或中性，pH在7.0～7.8之间，一般来说，精液密度越大pH值越小，精液密度越小pH值越大。柠檬酸钠等可以起到维持精子生存环境相对稳定，将稀释液的酸碱度维持在一个相对稳定的范围内，减少因酸碱化而导致精子死亡的作用。*第10页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四实验内容3、精液的稀释与平衡稀释前先检查精液的活率，一般不低于0.7，密度在8亿/mL左右，用与精液同温的稀释液做2-5倍稀释。将稀释后的精液用棉花包裹放入冰箱内缓慢降温到0-5℃，并保持2-4小时。*第11页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四实验内容4、滴冻和保存用吸管吸取平衡后的精液滴于液氮冷却到-100℃左右的铝饭盒的
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面（饭盒表面距液氮面2-3cm），制成0.1mL剂量的冷冻颗粒。滴冻要求快速、均匀，滴冻结束应使精液颗粒停留3min，待颗粒由黄变白，即可将饭盒盖浸入液氮。然后用青霉素瓶或纱布袋收集颗粒，做好标记，投入液氮罐中保存。*第12页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四实验内容5、解冻在1mL容量的试管内装入2.9%的柠檬酸钠解冻液1mL，放入4℃的水浴中，随后取1-2粒精液投入试管中，立即摇动直至颗粒融化再取试管，取样观察，凡活率在0.3以上即为合格*第13页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四谢谢观赏第14页，共14页，2022年，5月20日，15点8分，星期四
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