第五章 Separating Target Gene

ChapterFiveSeparatingTargetGene基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此，必须从现有的生物群体中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片断，称为目的基因。目的基因的获取主要采用：直接分离法基因文库法：基因组文库及cDNA文库化学合成法PCR扩增法第一节目的基因的直接分离1.限制性核酸内切酶酶切分离法■限制性核酸内切酶法适用于从简单的基因组中分离目的基因质粒及病毒等的基因组较为简单，编码的基因较少，因此可采用限制性核酸内切酶法分离其中的某些基因。■分离方法对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需的DNA片段。对已定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性核酸内切酶识别为点，用适当的限制性核酸内切酶酶切，一次就可获得目的基因。目的基因的DNA分子未定序也未定位，也只需先通过酶切分析，随后再通过部分酶切，克隆构建一个非常简单的基因组文库，从中钩出目的基因。2.物理化学法这是基因工程在发展初期所用的方法，目前已很少采用。其基本原理是DNA分子的两条链存在着G≡C、A﹦T碱基配对，其中GC间存在着3个氢键，AT间存在着2个氢键。如果不同基因的碱基组成差异较大，其理化性质如浮力密度、解链温度等也有明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组分离目的基因的目的。物理化学法分离目的基因的方法主要有：密度梯度离心法、单链酶解法、分子杂交法等。3.双抗体免疫法分离编码蛋白的基因双抗体免疫法分离基因适用于某一真核细胞的蛋白质已被分离纯化，且足以产生特定抗体。其基本原理如下：核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体。从细胞匀浆中制备这种多聚核糖核蛋白体，并同由待分离基因表达的蛋白产物制备的特定抗体一起保温，形成多聚核糖体同抗体的复合物。由于这种复合体数量甚微，难以从细胞总多聚核糖体中沉淀出来，但如加入由此特定蛋白的抗体产生的第二抗体时就可以通过不连续蔗糖密度梯度离心，将所要的含有待定mRNA的多聚核糖体从总多聚核糖体中分离出来，再通过一定的纯化过程，就可以得到为特定蛋白编码的mRNA。此后，通过反转录就可得到目的基因的cDNA。采用金色葡萄球菌中的proteinA可以与IgG产生免疫反应而代替二抗，由此发展出用proteinA-Sepharose4B作为亲和层析介质，通过亲和层析的方法分离特定多聚核糖体的技术，从而使双抗免疫法分离基因更为有效。4.利用酶促反转录法直接从特定mRNA中分离基因酶促反转录法主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离的目的基因。这种方法以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA，从而获得目的基因的cDNA。图5.1proteinA-Sepharose4B亲和层析介质及层析柱第二节构建基因组文库分离目的基因1.基因组文库（genomiclibrary）的概念某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。2.构建基因组文库的一般步骤限制性核酸内切酶部分酶切法选择适当的限制性核酸内切酶（如识别序列为4bp内切酶Sau3AI、AluI或HaeII等）部分酶切基因组DNA。其优点在于：片断的随机性较强，且末端为已知序列的粘末端，可以与载体直接进行连接。其缺点在于：粘末端之间可能发生自身连接或环化，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段将酶切DNA片段进行部分补平（但不影响其与载体的连接），使其不能再进行自身连接或环化。■载体的制备（以λ噬菌体载体为例）采用适当的限制性核酸内切酶切割λ噬菌体载体，分离去除载体的中间片段，回收载体的两臂。由于采用了与目的基因组片段化时所使用的相同限制性核酸内切酶，使其末端与目的基因的DNA片段互补或部分互补（相同的内切酶得到的末端互补，有些不同的内切酶识别位点序列虽然不同，但切割后得到的末端突出序列却互补）。■基因组DNA片段与λ噬菌体载体连接采用DNA连接酶将基因组DNA片段与λ噬菌体载体连接。■重组后的λ噬菌体克隆载体体外包装由于重组的λ噬菌体载体直接转染受体菌的效率很低，须在体外完成λ噬菌体颗粒的包装。■λ噬菌体颗粒感染受体菌，铺板筛选培养图5.2λ噬菌体载体构建的基因组文库图5.3λ噬菌体载体构建的基因组文库图5.4质粒载体构建的基因组文库3.构建基因组文库的克隆载体及基因组文库的大小载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的克隆的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少（片断越大），克隆的数目越小。目前常用的载体有：噬菌体载体系列，容量为24kb；cosmid载体，容量为50kb；YAC（酵母人工染色体)，容量为1Mb。一般情况下，一个完整的基因组文库所需的克隆数应取决于外源基因组的大小以及切割片段的大小。因此，基因组文库大小可用如下公式进行理论值的估算：基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长但实际上，该基因文库应含的克隆子数远远超过这个数。为此，1976年，Clark和Carbon提出一个经验公式用于估算基因组文库的大小，公式如下：N=ln（1-P）/ln（1-f）式中：N为基因组文库必须的克隆数目；P为文库中含目的基因DNA片段的出现概率；f为插入片段大小与全基因组大小的比值。例如：出现的概率为99%（P=0.99)，插入片段大小与全基因组大小比值为0.1（f=0.1），则N=ln（1-0.99）/ln(1-0.1)=46第三节构建cDNA文库分离目的基因1.cDNA及cDNA文库的概念cDNA（complementaryDNA）：以mRNA为模板逆转录出的DNA称为cDNA。cDNA文库：某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称cDNA文库。3’mRNA5’5’引物cDNA反转录酶2.构建cDNA文库的一般步骤组织或细胞mRNAcDNA大小分级可供克隆的cDNA片段载体（选择一种）连接片段和载体将重组载体导入大肠杆菌（体外包装或转化）滴定并鉴定文库筛选目的克隆扩增文库长期保存■分离细胞总RNA，并从总RNA中分离纯化出mRNA原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（mRNA、rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%~2%。提取总RNA有商业化的试剂盒,分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。■以mRNA分子为模板，合成cDNA第一链cDNA的合成是以mRNA分子为模板，在逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）的作用下，利用适当的引物引导合成的。常用的方法有两种：OligodT引导及随机引物引导。■双链cDNA的合成以cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA。采用的方法有：自我引导合成法、RNaseH降解置换法、Oligo（dG）寡聚引物引导合成法、PCR法、载体引物引导合成法、固相支持法等。■将合成的双链cDNA重组到载体上，导入大肠杆菌宿主细胞中增值■cDNA文库的保存或筛选目的克隆图5.5OligodT纤维柱分离mRNAAAAAAAAmRNA5’3’5’TTTTTTTcDNA反转录酶OligodT引物AAAAAAmRNA5’3’ATCGGAcDNA反转录酶CGTACTcDNA反转录酶随机引物OligodT引导第一链合成随机引物引导第一链合成图5.6以OligodT或随机引物引导第一链合成图5.7自身引导合成法合成cDNA第二链图5.8置换合成法合成cDNA第二链图5.9cDNA文库的构建3.两种文库特征及其用途 DNA组成建库目的材料来源DNA制备所用载体重组方式基因组文库染色体DNA，除含编码基因外，还含有大量基因内和基因间非编码部分（内含子、调控序列）基因组物理图谱基因组序列分析基因染色体定位基因组中基因结构功能分析体细胞（同一物种所有细胞所含DNA信息是一样的）DNA+限制性内切酶部分消化YAC粘粒噬菌体载体酶切后粘性末段cDNA文库cDNA，不含内含子和调控序列及两侧非编码序列特定组织、细胞不同阶段基因表达谱（转录谱）；基因及其表达产物分离，鉴定特定环境下不同组织和细胞（表达的mRNA的种类和丰度是不同的）mRNA经反转录sscDNAdsDNA噬菌体载体质粒同聚物加尾DNA接头或衔接头等第四节基因文库中目的基因的分离成功构建一个完整的基因组文库或cDNA文库，意味着包含目的基因在内的所有基因都得以克隆，但这并不等于完成了目的基因的分离。因为在基因组文库或cDNA文库中，含目的基因的克隆子都只是数以万计克隆子中的一个，其中哪一个克隆子含有我们所要研究的目的基因序列尚不得而知。因此，克隆一个基因的下一个步骤就是从基因文库中筛选分离出含有目的基因的特定克隆子。从基因组文库或cDNA文库中分离含有目的基因的克隆子，可以根据待分离基因的有关特性建立相应的方法加以完成，主要的方法有以下几种：1.目的基因的功能克隆目的基因的功能克隆是根据目的基因编码的蛋白质的生物学功能来进行基因分离的。■根据特异蛋白分离目的基因这是在基因工程发展的早期阶段较常使用的方法。其基本过程是：a：通过聚丙烯凝胶电泳或其它蛋白分离技术从生物体的组织和器官中分离出一定发育时期的的特异蛋白。b：应用蛋白质测序技术测定特异蛋白的氨基酸顺序，然后按照遗传密码及其简并性推测编码该蛋白的核苷酸序列。c：人工合成一段寡核苷酸片段作为探针，从基因组文库或cDNA文库中筛选相应的基因。b2：以分离纯化的特异蛋白作为抗原制备相应的抗体。c2：用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选目的基因。■功能互补法克隆基因这种方法主要利用目的基因与宿主细胞的染色体DNA在功能上有同源互补性来进行目的基因的直接分离的。举例：面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的分离2.序列克隆法根据目的基因的核苷酸序列分离目的基因。■根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因其基本原理是：先从DNA序列数据库（如GenBank）中查找目的基因的部分序列或其同源基因的序列，再用目的基因或其同源基因的部分序列合成核酸探针。用核酸探针与基因组文库或cDNA文库进行杂交，从而获取含目的基因的克隆子。■表达序列标签法分离目的基因适用于从cDNA文库中一次性大量分离各种已知及未知基因。其基本步骤如下：a：从组织特异性或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆，进行5’端和3’端部分序列（约400bp）的测定。b：通过对DNA序列数据库（如GenBank）进行联机检索，可以检测出许多已知基因和许多未知基因。c：通过对基因文库的筛选或基因定位的方法分离目的基因。■基因表达系列分析法此方法可以用来分离在不同发育阶段和生理状态下差别表达的基因。其优点在于可以一次性对大量基因的转录产物进行定量分析，从中找出新的基因。3.差别杂交及减法杂交技术■差别杂交法差别杂交法适用于分离在特定组织中或特定发育阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因，也可有效地来分离经特殊处理诱导表达的基因。原理：a：制备两种不同的细胞群体，在一个细胞群中目的基因能够表达，而在另一个细胞群体中目的基因不能够表达。b：分别制备两种不同细胞群体的mRNA，其中一个群体含有一定比例的目的基因mRNA，另一个群体不含有目的基因mRNA。c：以两种总mRNA（或它们的cDNA拷贝）为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都呈阳性反应，而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余菌落都呈阳性反应。d：通过对比，即可挑选出含目的基因的菌落。举例：分离血清诱导表达的生长因子调节基因■减法杂交技术该技术是通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。减法杂交的对象可以是基因组DNA，也可以是cDNA，相应的称为基因组DNA减法杂交和mRNA减法杂交。mRNA减法杂交原理：利用羟磷灰石柱只结合单链DNA，不结合双链DNA。从表达该蛋白和不表达该蛋白的组织细胞中分别提取和分离mRNA。特异表达该蛋白的组织的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达组织的mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行克隆。举例：T细胞受体编码基因的分离基因组DNA减法杂交主要用来分离缺失突变基因。4.利用差示分析法分离目的基因■mRNA差别显示技术该方法主要用于分离不同（处理）组织或细胞中差别表达的mRNA。其基本原理如下：a：真核生物中绝大多数mRNA均带有poly（A）尾巴结构，在RNA聚合酶作用下，可按mRNA为模板，以oligo（dT）为引物合成出cDNA拷贝。在poly（A）上游的两个碱基只有12种可能的排列组合，因此可总共合成12种不同的3’端引物（oligo（dT）11MN或oligo（dT）12MN）。b： 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 20种由10个核苷酸组成的5’端随机引物。c：12种不同的3’端引物和20种5’端随机引物组成240组引物对做PCR扩增，应能得到20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定的mRNA种类。这个数字大体涵盖了在一定发育阶段某种类型细胞中所表达的全部mRNA种类。d：在PCR反应中加入放射性物质标记反应产物。PCR反应完成后，对产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影可发现一对引物在凝胶板上可显示60~160个条带，条带大小在100~150bp范围。在同一胶板上进行不同样品的对比，就可显示出差异表达的条带。e：将差异条带从胶上切割下来，回收cDNA，利用该片段制备探针进行cDNA文库或基因组文库的筛选，以分离差别显示的基因。■代表性差别分析技术■抑止性减法杂交技术■基因组错配筛选5.功能结合法筛选目的基因该方法是针对cDNA表达文库来分离目的cDNA克隆子。原理：根据目的基因表达产物的某种结合功能完成目的基因的分离筛选。■根据受体/配体结合、酶和底物结合分离目的基因在钙离子存在时，钙调蛋白能与多个酶形成稳定的复合物。利用这一生物学特征，用放射性标记的钙调蛋白作为探针，筛选表达产物能与钙调蛋白结合的cDNA克隆子，结果在大脑组织中找到一个新的Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶亚单位。■根据基因表达调控蛋白能与特异的DNA片断结合分离编码基因表达调控蛋白的基因用一段已知有蛋白质结合位点的DNA片断作为筛选cDNA文库的探针，在一定条件下，该探针将特异性的与DNA结合蛋白结合。用这种方法已分离鉴定了多种特异的DNA结合蛋白基因。6.DNA插入诱变法分离目的基因该方法主要用于植物目的基因的克隆分离研究。原理：当一段特定的DNA序列插入植物基因的内部或其邻近位置时，一般会诱导该基因发生突变形成突变体植株，或者在插入位置产生一个新的基因。如果该DNA插入序列是已知的，便可用它作为DNA分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选到突变基因的片断。然后再利用此突变基因片断制备探针，从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。EcoRI部分酶切酵母基因组DNAλ噬菌体克隆载体相互连接成为重组的DNA重组DNA转入吲哚甘油磷酸脱氢酶组氨酸缺陷型大肠杆菌菌株中菌株在不含有组氨酸营养源的培养基上培养能正常生长的菌株不能正常生长的菌株菌株中含有面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因菌株中不含有该基因分离吲哚甘油磷酸脱氢酶基因图5.10面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的分离静息状态的细胞（不表达生长因子调节基因）添加血清生长期细胞（表达生长因子调节基因）分离mRNA分离mRNA其它mRNA其它mRNA、生长因子调节基因的mRNA逆转录制备cDNA探针逆转录制备cDNA探针构建cDNA文库，转入E.coli中其它基因的cDNA探针及生长因子调节基因的cDNA探针含生长因子调节基因的cDNA文库其它基因的cDNA探针复制到硝酸纤维素膜上含生长因子调节基因的cDNA文库硝酸纤维素膜探针与硝酸纤维素膜杂交探针与硝酸纤维素膜杂交所有菌落都可与探针进行杂交除含生长因子调节基因的菌落外，其它菌落都可与探针进行杂交从cDNA文库中分离未杂交菌落分离生长因子调节基因图5.11分离血清诱导表达的生长因子调节基因T细胞B细胞总mRNA（T）总mRNA（B）含T细胞受体的mRNA不含T细胞受体的mRNA总cDNA第一链杂交T细胞受体的cDNA不能杂交含T细胞受体的cDNA羟磷灰石柱羟磷灰石柱过柱吸收单链DNA图5.12T细胞受体编码基因的分离洗脱T细胞受体cDNA制备递减探针用于杂交制备递减cDNA文库图5.12T细胞受体编码基因的分离野生型DNAABC缺失突变型DNAAC限制性内切酶酶切ABCAC变性、复性再结合ACB包裹着生物素的小磁珠AC通过生物素结合蛋白支柱超生波随机切割后，用生物素标记BBBPCR反应未结合的DNAB重组、转化BB图5.13基因组DNA减法杂交分离缺失突变基因对照组织/细胞总RNA处理组织/细胞总RNAoligo（dT）12MN反转录反转录cDNAcDNAPCRPCR5’端随机引物PCR产物PCR产物差别条带取下差异条带，再次PCR，制成探针或克隆Northern印迹和克隆分析，寻找相关的新基因图5.14mRNA差别显示技术第五节目的基因的化学合成1976年，KhoranaHG就提出了用化学方法合成基因的设想，并在1979年在Science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。1.化学法合成目的基因的常用方法目前的方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法和自动化合成法。■磷酸二酯法原理：（1）保护dNTP的5’端或3’端的-OH，保证合成反应的定向进行，然后再用酸或碱把保护基团脱去。（2）带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。脱保护后就可反复进行。（3）各种保护基团可以用酸或碱的脱保护作用去掉。■磷酸三酯法原理与磷酸二酯法一样，只是参加反应的单核苷酸都是在3’单磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。■固相亚磷酸三酯合成法将第一个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上，再按上述方法依次定向延长。最后把合成的整条DNA从固相载体上切除下来并洗脱保护基团。是目前通用的合成方法。■自动合成法采用固相亚磷酸三酯法的原理，在DNA合成仪上完成。2.化学合成DNA片段的组装化学合成的DNA片段一般局限在200bp以内，一般必须把几条这样的片段正确组装连接起来才能成为完整的基因。DNA片段的组装一般采用两种方法：■预先设计合成的片段都有互补区域，用不同片断之间的互补区域形成双链，用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸基团，再用DNA连接酶连成完整的双链。■预先设计的片段之间有互补区，可以相互作为另一个片段延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3.化学合成的寡聚核苷酸的用途合成基因：有些组织特异性mRNA的含量很低，很难用cDNA方法克隆。合成测序或PCR用的引物（20bp左右）。合成探针序列，以筛选特定的基因。合成带有定点突变的基因片段，进行基因定点突变研究。合成含有各种酶切位点的人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。基因合成一般都是自己设计序列，交给商业公司合成。图5.15磷酸二酯法合成DNA片段图5.16固相亚磷酸三酯法合成DNA片段四唑催化图5.17DNA合成仪5’5’5’5’5’5’5’T4多核苷酸激酶使5’端OH磷酸化5’依靠互补序列形成双链5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’P-P-P-P--P-P-P-PT4DNA连接酶将3’端OH与5’端磷酸基连接5’5’图5.18化学合成DNA片段的组装5’5’Klenow片段T4DNA连接酶图5.19化学合成DNA片段的组装