蛋白质工程学考试复习

一、蛋白质 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 的概念工程化：理念－ 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 －制造－功能实现以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。蛋白质工程产生的标志1982年，Winter等首次报道了通过定点诱变获得改性的酪氨酸tRNA合成酶(Nature,299,1982)1983年，Ulmer首先提出了“ProteinEngineering”的概念（Science,1983，219:666-671）Theprospectsforproteinengineering,includingtherolesofx-raycrystallography,chemicalsynthesisofDNA,andcomputermodellingofproteinstructureandfolding,arediscussed.---Deliberatedesignandproductionofproteinswithnoveloralteredstructureandproperties,thatarenotfoundinnaturalproteins.三、蛋白质工程的研究内容以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。1.蛋白质结构分析&功能研究——基础（关系学）2.结构、功能的设计和预测——基础的应用与验证（实验科学）3.创造和/或改造蛋白质——终目标（工程学）蛋白质工程的支撑技术定点突变等遗传操作技术蛋白质结构解析技术生物信息学分析技术蛋白质的设计、表达、生产技术如何认识蛋白质？蛋白质家族（family）一组进化上相关的蛋白质，这些蛋白质共享一个或多个结构域蛋白质的物理性质等电点、分子量、沉降系数、分子半径、跨膜区结构域等蛋白质的细胞定位在细胞中定位（cellularcomponent）蛋白质的生物功能哪个生化过程中起作用（biologicalprocess），起怎样的分子功能（molecularfunction）L-型的氨基酸构型configuration：一个分子中原子的特定空间排布（L-型的单一手性分子）构型转化时必须有共价键的断裂和重新形成不同构型分子除镜面操作外不能以任何方式重合化学上可以分离，不可由单键旋转相互转换构象conformation：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布构象转化时不需要共价键的断裂和重新形成化学上难以区分和分离1.α-螺旋结构（α-helix）多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构.莱纳斯·卡尔·鲍林肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行。中心无空腔。稳定蛋白质分子为右手-螺旋。β折叠的结构特点氢键是在片层间而不是片层内形成。在平行（a）和反平行（b）β－折叠片中氢键的排列平行式构象：φ=-119O，ψ=＋113O　反平行式：　φ=-139O，ψ=＋135O3.转角（turn)3.1．β转角(-turn)由四个AA组成;第一个AA的-C=O和第四个AA的–N-H之间形成氢键一个不很稳定的环状结构。3.2．γ转角(γ-turn)由3个AA构成的转角四、维系蛋白质结构的作用力肽键二硫键氢键离子键金属离子配位键疏水键范德华力第二遗传密码现有的遗传密码仅有从核酸序列到无结构的多肽链的信息传递，因此是不完整的。无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分—遗传密码的第二部分，即蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密码3.第二遗传密码的特点简并性氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构。多意性相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构。全局性和复杂性在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用，并对分子总体结构产生重要影响；后形成的肽段可以影响已经形成的肽段的构象从而造成对分子整体的影响等。一、蛋白质和新生肽链折叠新生肽链的折叠不仅指肽链在空间的盘旋卷曲，而是包括广义的新生肽链的整个成熟过程，包括化学修饰、跨膜转运、亚基组装、水解激活等。蛋白质的折叠(proteinfolding)从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。3.体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠的区别完整肽链在试管内的重折叠相当于翻译完成后才折叠，与新生肽链的合成延伸与折叠同时进行不同。细胞内新生肽链折叠是一个比蛋白质体外重折叠快得多的过程。温度、浓度、pH值不同细胞和试管另一个重要差别是“大分子拥挤”问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。三、帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子分子伴侣（molecularchaperone）折叠酶：催化与折叠直接有关的化学反应的酶。蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI)肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase,PPI)molecularchaperoneAlargeanddiversegroupofunrelatedproteinsthatallsharethefunctionalpropertyofassistingthenoncovalentassemblyand/ordisassemblyofproteincontainingstructuresinvivo,butarenotpermanentcomponentsofthesestructureswhentheyareperformingtheirnormalbiologicalfunctions.一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。分子伴侣的定义完全是功能上的。分子伴侣与酶的异同点相同点参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现不同点分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性分子伴侣的催化效率很低分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进其正确折叠。1.2分子伴侣与酶的异同点1.3分子伴侣在蛋白质分子折叠中的作用分子伴侣首先会识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然构象，而不会去理会天然构象。与这些中间物结合，生成复合物，防止过早的或者错误的相互作用而阻止不正确的无效的折叠途径，抑制不可逆的聚合物的产生，促进折叠向正确的有效的途径进行。分子伴侣与早期形成的中间物相互作用而防止它们之间的聚合。由分子伴侣和靠消耗三磷酸腺苷的能量而发挥作用的特定的蛋白水解酶组成。分子伴侣帮助新生肽正确折叠；而特定的蛋白水解酶把不能继续正确折叠的或错误折叠的“垃圾”水解成小分子。分诊治疗机制（triage）如何“诊断”和区分什么样的新生肽“病人”可以送到分子伴侣“病房”进行治疗和拯救，而什么样的新生肽“病人”已“无可救药”，只能送给蛋白水解酶去处理。细胞内新生肽“病人”的命运主要是由分子伴侣处理“病人”的能力和速度在动力学上来决定的。1.熵判据和蛋白质折叠未折叠的状态包含很多具有不同构象的分子。2.吉布斯自由能判据和蛋白质折叠ΔG=ΔH-TΔS1.TheLevinthalParadox当蛋白折叠是构象搜索时，将会有太多的构象需要尝试。仅仅考虑蛋白的主链，每个残基在未折叠时假设只有3个构象，对一个有100AA的多肽来说将有3100构象。如果构象搜索的速度是1012构象/s，需要5x1035s(1.6x1028y)蛋白质折叠不是随机的，而是有捷径的。常见“折叠病”老年性痴呆症(Alzheimersyndrome)病人脑中充满了由错误折叠蛋白形成的杂乱的蛋白质簇。主要分为两类：含有沉淀样β蛋白（Aβ）的沉淀样斑，tau蛋白引起的神经细胞内自损伤。帕金森氏症（Parkinsondisease）主要是由于蛋白质的错误折叠，病人随意运动的控制能力逐渐丧失，因为能产生多巴胺的神经细胞逐步被破坏，其原因和发生机制尚不清楚。某些肿瘤抑癌基因突变造成抑癌基因编码的蛋白质稳定性改变引起的一些癌症的发生。p53稳定性的降低导致癌症的发生。2设计层次分类基于天然蛋白质结构的分子设计“小改”：定位突变和化学修饰“中改”：结构域进行拼接组装全新蛋白质设计（“大改”）完全从头设计全新的蛋白质——Knowledge-basedapproach——cycle1甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸分子量都比较小灵活性Gly>Ala>Pro甘氨酸具有高度柔韧性，可在α螺旋、β折叠处出现，但更常见于铰链区或β转角。Gly在定点突变时，一般不宜随意改变Pro比较刚性，常出现在β转角Ala处于二者之间，常用作取代别的氨基酸的首选。Pro和Gly是α螺旋的中断者ⅠMethodsSpecificOldspecificDNAshufflingCassettemutugenesisNewspecificOligo-directedsitemutagenesisPCRbasedsitemutagenesisUnspecificOldunspecificUVX-rayOtherchemicalNewunspecifictransposonsdegeneratedprimerstransposons转座子:细胞中能改变自身位置的一段DNA会跳舞的基因从染色体的一个位置跳到另一位置，从一个染色体跳到另一染色体。ⅢOligo-directedsitemutagenesis•ssDNA(M13method)anddsDNAKunkelmethodDpnImethodAntibioticresistanceRE-site2.CrossoverPCR重叠延伸PCR的原理为采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。该方法首先在特定的待突变位点和上下游分别设计引物，引物A、B为上下游引物，且分别与模板链互补，引物C、D为突变引物。先以引物B、C进行PCR，得产物BC，再以引物A、D进行PCR得AD，混合扩增产物，以A、B为引物进行扩增，可得到具有突变位点的DNA片段。ⅥGenefusionandgenelinkMethodsofGenefusionandgenelinkViaREViasilentmutationcreatuniqueREViacrossoverPCRViainteintRNA-mediatedproteinengineeringIncorporationofnon-naturalaminoacidsintoproteins蛋白质化学修饰的意义改变蛋白质的药代动力学调解蛋白质的稳定性以及活性改变蛋白质的空间构象荧光标记靶点成像与临床检测概念凡是通过化学基团或离子的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白质的化学修饰侧链基团的改变——化学修饰的范畴主链结构的改变——分子生物学基因重组和定点突变体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物+蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基、酚基等。还原剂：2－巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等。可被还原的侧链基团：二硫键。3)氧化/还原反应1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。蛋白质的表达系统40关于表达载体的一些分子生物学概念启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。-10区（pribnowbox）和-35区组成分类转录形式组成型诱导型强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。41T7噬菌体编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。T7表达系统42核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）概念-核糖体结合位点43选择合适的载体载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因。只有3种转录载体：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因选择合适的载体需要考虑的因素：目的蛋白的应用目的蛋白已知特定信息克隆策略44蛋白纯化方法类别分离原理基质或载体凝胶层析分子筛的排阻效应sepharose、sephadex离子交换层析离子基团的交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸亲和层析分离物与配体之间有带配基的sepharose特殊亲和力或sephadex疏水相互作用层析疏水性差异琼脂糖45蛋白质三维结构解析2016-10-09蛋白质三维结构测定方法及数量X射线衍射的获得波长范围：100—0.1埃欲观察其衍射现象则衍射线度应与其波长差不多，晶体的晶格常数恰是这样的线度晶胞(Unitcell)空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。二、X射线晶体结构测定基本过程①蛋白质获取②晶体生长③X射线衍射数据收集④结构模型的获取（包括修正）http://www.tudou.com/programs/view/wBTB8KWJypw/晶体的初步鉴定小分子晶体蛋白质晶体边界完整，漂亮常不完整，易出现多晶硬度偏硬，易碎成2瓣或几瓣偏软，易碎成粉脱水不变化因脱水而变坏溶解性慢快偏光性强相对弱染色性弱强漂浮性下沉漂浮定义：核磁共振现象（nuclearmagneticresonance，NMR）是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeemansplitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radiofrequency,RF）的物理过程。一、核磁共振原理二、几个重要波谱 参数 转速和进给参数表a氧化沟运行参数高温蒸汽处理医疗废物pid参数自整定算法口腔医院集中消毒供应 化学势（位）移：在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。来源于核外电子云的磁屏蔽效应大小与外加磁场强度成正比NOE与蛋白质结构信息是三维结构的主要实验依据可以直接反映蛋白质中质子对间的距离2个质子间越近，NOE信号强度越大有相邻氨基酸残基，短程，NOE强相隔1~4个氨基酸残基，中程；以及相隔5个以上氨基酸残基的远程，NOE弱基因组(genome=gene+chromosome):生物体所拥有的全套染色体上的全部基因转录组(transcriptome=transcript+genome):一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套mRNA蛋白质组（Proteome＝PROTEins+genOME）：一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质代谢组（metabonome=metabolite+genome）一种细胞、组织或生物体所产生的所有代谢产物。组学蛋白质组学（Proteomics）蛋白质组学:研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学同基因组学一样,蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系,而是一个领域。是研究基因组ＤＮＡ序列与基因功能之间的桥梁基于2DE的差异蛋白质组学分析技术流程:ESI-MS/MSMAIDI-TOF图像分析确定差异点差异蛋白质质谱分析数据处理与生物信息学分析数据搜寻蛋白质鉴定条件A:样品条件B:样品1.蛋白质组研究整体技术的特点规模化通量化自动化2.技术目标（要求）有效分离准确鉴定合理分析蛋白质质谱技术质谱工作流程进样系统离子源质量分析器离子检测器1.加热进样2.直接进样1.离子阱2.飞行时间3.四极杆（三级联用）4.傅里叶变化离子回旋共振1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光轰击5.快原子轰击6.电喷雾离子化7.基质辅助激光解吸附电离（MALDI）8.表面增强激光解析电离SELDIMALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定3.1基质辅助激光解吸电离Matrix-assistedlaserdesorption/ionization,MALDI电喷雾离子化（ElectrosprayIonizsation，ESI）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。3.2电喷雾电离（ESI）概念生物芯片的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 有规则（ordered）显微尺度(microscopic)平面的(planar)特异性地吸附(specific)寡核苷酸原位光刻合成专利技术http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html生物芯片3种制作方法网络是生命结构和活动的基础生物体中绝大多数蛋白质都是形成复杂的蛋白质复合体和相互作用网络而发挥其功能和活性作用的。蛋白质相互作用技术免疫共沉淀融合蛋白pulldown蛋白质芯片原子力显微镜表面等离子体共振酵母双杂交表面展示蛋白质片段互补策略ConfocalmicroscopyFRETDNA序列分析2.FRET当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。1.定义表面展示技术是利用基因工程手段将外源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。2.展示系统分类CellbasedCellfreePhagedisplayCellsurfacedisplayRibosomedisplaymRNADisplayDisplaySystem2.M13噬菌体的组成和结构StructureofM13filamentousphage单链DNA病毒,6407bp。基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白质。与展示密切相关的有两种结构蛋白质。3.消逝波和等离子波发生共振