谷氨酰胺转胺酶及其在食品工业中的作用

《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 N0．5 谷氨酰胺转胺酶及其在食品工业中的作用 寇明钰 赵国华 阚健全 (西南农业大学食品学院，重庆 400716) 摘 要：谷氨酰胺转胺酶是一种新型的酶制剂，可使蛋白质分子或多肽链之间发生共价交联，从而改善蛋 白质凝胶特性、营养价值以及增强乳化稳定性和热稳定性等。本文介绍了谷氨酰胺转胺酶的来源、作用机理、影 响其反应的因素及谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的作用。 关键词：谷氨酰胺转胺酶，凝胶，蛋白质，交联 Transglutaminase and its Application in Food Industry Kou Mingyu，Zhao Guohua，Kan Jianquan (Food Science College，Southwest Agn。cultural University，Chongqing 4007 1 6) Abstract：Transglutaminase as a new enzyme preparation could introduce a covalent cross link between protein and pep— tide，which improved the properties，such as gelation，emulsification and thermostability，and enhanced the nutritional val— ues of protein．In this paper，the source of transglutaminase，the mechanisms and the influencing factors of reaction，as well as transglutaminase’S function in the food industry ． were discussed． Key words：Transglutaminase，Gelation，Protein，Cross—link 前 言 谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase)又称转谷 氨酰胺酶，系统名称为蛋白质一谷氨酸一 一谷 氨酰胺基转移酶(EC2．3．2．13，TGase)，可以催化 蛋白质分子内的交联、分子间的交联、蛋白质和氨 基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的 水解，从而可以改善蛋白质功能性质，提高蛋白质 的营养价值 因此，谷氨酰胺转胺酶被认为是一种 可生产出满足人们需要的新型蛋白质产品的酶制 剂。它广泛存在于动物、植物和微生物的各种组织 器官(如肝脏、表皮、血液等)。天然来源的谷氨酰 胺转胺酶成本高，资源相对稀缺，不能满足工业化 应用的要求。1989年 Ando和 Motoki等人首先报 道了利用微生物发酵生产谷氨酰胺转胺酶的情 况 ，并且 日本味之素公司已经开始生产谷氨酰 胺转胺酶并己投放到了市场，这为工业化应用谷氨 酰胺转胺酶奠定了良好的物质基础。 l 谷氨酰胺转胺酶的特性 1．1 谷氨酰胺转胺酶的理化性质 谷氨酰胺转胺酶是一种球状单体蛋白，亲水性 高，商品酶制剂活性一般为 22．6U／mg，等电点 8．9，分子质量40 000，最适温度5Oo【=，最适 pH 6～ 7，对热稳定。 1．2 谷氨酰胺转胺酶的来源 目前，研究或工业用的 TGase有下面几个来 源：一是从动物(猪、牛、鱼、豚鼠)的组织、体液或 屠宰血液中提取；二是采用转基因的方法，如将豚 鼠肝脏、鱼的TGase基因转入到大肠杆菌中，人的 xma因子基因转入到酵母中，培养基因工程菌来 生产 TGase；三是大量筛选能产生 TGase的微生 物，用传统的发酵方法生产，这是最可能开发成商 业应用的一种谷氨酰胺转胺酶生产方法，这样得到 的TGase称为微生物谷氨酰胺转胺酶(MTGase)。 已报 道 茂 原 链 轮 丝 菌 (Streptoverticillum mob一 81 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．5 araense)的一个变种具有较高的产酶能力，另外，王 灼维和王璋 研制出了由链霉菌生产谷氨酰氨转 氨酶的发酵工艺，并选育出了一株高产 MGTase的 菌株。现在，结合第二和第三种方法，将 MTGase 在大肠杆菌中表达，得到重组微生物谷氨酰胺转胺 酶(rMTGase)，据 Yokoyama等 报道这种方法的 特点在于可以快速方便的得到大量的 rMTGase，纯 度较高，但 rMTGase易聚集，交联能力低于天然的 MTGase，且热稳定性低于MTGase的热稳定性。 1．3 谷氨酰胺转胺酶的作用机理 在谷氨酰胺转胺酶的作用过程中，以 一羧酸 酰胺基作为酰基供体，而其酰基受体有以下几种： (1)伯胺基。如式 1所示，通过此方法，可以将一 些限制性氨基酸引入蛋白质中，提高蛋白质的额外 营养价值。Folk等(1973年)成功地将腐胺，尸胺 或赖氨酸结合到蛋白质。(2)多肽链中赖氨酸残 基的e-氨基。如式 2所示，通过此方法能形成 e- 赖氨酸异肽链。食品工业中广泛运用此法使蛋白 质分子发生交联，从而改变食物的质地和结构，改 善蛋白质的溶解性、起泡性等物理性质。(3)水。 当不存在伯胺基时，如3式所示，形成谷氨酸残基， 从而改变蛋白质的溶解度，乳化性质和起泡性质。 R．G1 u．CO．NH，+NH，．R’ — R．G1 u．CO．NH． R’．NH，⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 1 R．Glu．CO．NH，+NH，．Lys— R’— R．G1 u．CO． NH．Lys．R’+NH ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 2 R-G1 u—CO-NH，+H，O— R．G1 u．CO．OH +NH ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 3 2 影响谷氨酰胺转胺酶活性的因素 2．1 谷氨酰胺转胺酶的来源 de Jong等 [5j(2001)对食品工业中使用的不 同来源的TGase的活性进行了比较，发现，对于哺 乳动物血浆和红血球中的 TGase与茂原链轮丝菌 的TGase而言，后者能催化更多的底物蛋白质发生 反应，且活力更高。B-酪蛋白交联的定量分析表明 MTGase较血浆和红血球中的TGase而言，具有更 高的活性。表 1 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 了一些 TGase对食品中某些 蛋白质所表现出的活性差异。 表 1 不同TGase对底物蛋白质的活性差异 无交联 ；±缓慢交联；+中速交联 ；++快速交联 血浆TGase和 MTGase另一个不同之处在于， 前者在血液中以蛋白酶原形式存在，需要被凝血酶 激活，而后者则以它的活性形式存在 j。 2．2 金属离子 MTGase的活性不依赖 Ca“，而豚鼠肝脏的谷 氨酰胺转胺酶对 Ca 具有依赖性。食品中蛋白质 如酪蛋白、大豆球蛋白、肌蛋白对 Ca 敏感，在 ca“存在下易沉淀，对酶的反应活性降低，而 MT- Gase对 ca 的不依赖性使其应用起来更加方便。 cu 、zn 、Pb 等重金属离子可与酶活性部位的 半胱氨酸残基上巯基结合，对 MTGase的活性有明 82 显的抑制作用。 2．3 蛋白质底物的结构 TGase使蛋白质交联的一个先决条件是蛋白 质底物需要具有足够的能相互作用的赖氨酸和谷 氨酰胺。一些蛋白质，如酪蛋白和明胶，非常容易 在 MGTase作用下发生交联，因为它们具有大量赖 氨酸和谷氨酰胺，且能相互作用，而一些食品中的 蛋白质，如 Ot一乳 白蛋白较难能被 TGase作用交 联，因为它们的结构更具有刚性，从而阻止了交联 的进行。 将一些具有还原性质的物质添加入 TGase反 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2o04 No．5 应体系中，它们能通过改变蛋白质底物的结构而促 进TGase催化的交联反应的进行。如在二硫苏糖 醇(DTY)的作用下，破坏蛋白质的二硫键，使蛋白 质暴露出更多的可反应基团，发生蛋白质交联。如 仅一乳白蛋和B一乳球蛋白加人 DTY后，均能在TGase 作用下发生交联。由于 DTY未达到食品级要求， 所以在食品工业中常常使用半胱氨酸或亚硫酸盐 代替 DTY。 唐传核等 研究了底物蛋白分子结构对 MT． Gase催化活性的影响，发现酪蛋白酸钠在谷氨酰 胺转胺酶催化下最容易聚合，其次为牛血清白蛋白 和大豆球蛋白，最难的为 B一乳球蛋白、仅一乳白蛋 白以及大豆 B一伴豆球蛋白。 2．4 其他环境因素 高温和改变低 pH值都将对 TGase反应产生 抑制作用，但在食品工业中，高温会改变蛋白质的 结构及功能性质，低 pH值会使蛋白质沉淀，因此 这两种方法实际都不可行。为了寻找一种方法，既 可控制 TGase反应的进行，又不改变交联蛋白质的 理化性质，迄今为止只有少数几种合成的TGase抑 制剂能起到这样的作用，如 N一乙基一顺丁烯二酰亚 胺，二氯乙酰胺和对汞苯甲酸。 2．5 谷氨酰胺转胺酶的存在形式 固定化 TGase的反应活性小于 自由形式的 TGase，因为 TGase固定化后改变了它的动力学性 质，也改变了其与反应底物的相互作用。0h等 采用多聚 仅一赖氨酸为隔板，将豚鼠的肝脏 TGase 固定于 3。氨基丙基多孑L玻璃杯，仅．酪蛋白和 B哥L 球蛋白仍能交联，但反应速率小于自由TGase的作 用，而且，此时表现出更高的选择性，因为固定化 GTase对 Ot一酪蛋白的亲和性大于对 B哥L球蛋白的 亲和力。De Jong(未公开发表)将 MTGase成功的 固定于 CNBr一和 CH一活化的琼脂糖凝胶，选用例如 单丹磺酰尸胺这类小分子作底物与二甲基酪蛋白 作用，发现 固定化 的 MTGase的活性 只是 自由 TGase的40％，如果选用 B一酪蛋白作底物，MTGase 相对活性仅为4％。 3 谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的作用 3．1 改善蛋白质凝胶的特性 由于引人了新的共价键，蛋白质分子内或分子 间的网络结构增强，会使通常条件下不能形成凝胶 的乳蛋白形成凝胶，或使凝胶特性发生很大改变。 蛋白质凝胶性能的变化表现在凝胶的强度提高、凝 胶的耐热性和耐酸性增强、凝胶的水合作用增强， 使凝胶 网络中的水分不易析出等。Chen T等 。¨。报道，在壳聚糖存在下，利用 GTase催化明胶交 联，所得到的凝胶强度大于利用蘑菇酪氨酸酶催化 壳聚糖和明胶混合物，且形成的明胶．壳聚糖凝胶 具有热不可逆性。J．C．Ramirez．Suarez and Y．L． Xiong ¨利用 MTGase催化肌原纤维蛋白(MPI)和 大豆蛋白分离物(SPI)交联，发现与未处理的样品 相比较，前者形成的凝胶强度显著大于后者(P< 0．05)。 牛乳经谷氨酰胺转胺酶处理制成脱脂乳粉，此 脱脂乳粉在水溶液中形成凝胶的强度比未经处理 的乳粉形成的凝胶强度大，凝胶持水性也得到提 高。这种脱脂乳粉可用于低脂酸奶的生产，防止酸 奶发生乳清析出。牛乳先经TGase处理，所生产酸 奶的凝胶强度比未处理的样品显著提高，乳清析出 显著减少，酸奶的稳定性更好 ¨。 利用 GTase可以解决水产品中凝胶的脱水收 缩作用。如在制作鱼香肠时，加入 GTase处理后， 其脱水收缩现象明显降低，其机理是 GTase作用蛋 白质后形成交联键，对水分子有包容束缚能力。据 Ramirez等人的报道，利用盐和 MTGase改变鱼香 肠的质构，加入 1％的食盐、0．3％MTGase可调整 鱼香肠的硬度为2773g、凝胶强度为 29106g／em 、 粘度为0．233mPa／s、持水量为 11．6％ 13j。 3．2 提高蛋白质的乳化稳定性 Liu Mingxia研究了 B一酪蛋白经 TGase不同程 度的作用后乳化性质的变化。经 TGase作用，B．酪 蛋白可形成二聚物、三聚物或多聚物，所形成的乳 化体系的稳定性明显提高，乳化液的稳定性随着聚 合程度增加而增加。分析天然 p．酪蛋白和 p．酪蛋 白聚合物混合液的乳化稳定性，发现随着混合液中 聚合物比例增大，该混合液的乳化稳定性增加。乳 化稳定性提高的原因在于，多聚物 B一酪蛋白分子 的粘弹性比单体 p．酪蛋白分子要高。p．酪蛋白形 成多聚物后，会产生许多支链基团，使蛋白质颗粒 的空间排斥力增加，界面蛋白质不易聚集。 3．3 提高蛋白质的热稳定性 加热处理易使蛋白质变性，降低其功能特性。 在奶粉生产中，如何防止奶粉在贮藏、销售过程中 83 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2o04 No．5 受热结块，一直是个急需解决的问题。奶粉的玻璃 化温度与奶粉结块有密切关系，奶粉加工或贮藏过 程中，由于局部受热会使某些成分呈现一种熔融的 玻璃状态，温度下降后，就易结块变硬，玻璃化温度 越低越易出现结块现象。酪蛋白是奶粉中的主要 成分，酪蛋白的玻璃化温度对奶粉的玻璃化温度有 重要影响。酪蛋白经TGase催化形成网络结构后， 其玻璃化温度可明显提高，这主要是因为TGase处 理后，酪蛋白分子间发生共价交联，增大了蛋白质 的分子键能，使其玻璃化需要更多的能量，即需要 更高的温度。经 TCase改性后的酪蛋白多聚物的 玻璃化温度随多聚物分子量增大而提高。蛋白质 中水分含量的增加会降低玻璃化温度。因此，牛奶 先用 TGase处理，再干制成奶粉，将有助于防止奶 粉结块硬化。经 TGase催化交联的乳球蛋白也表 现出较高的热稳定性，1％的聚合乳球蛋白即使在 100。C的条件下也可保持30rain不变性，而天然乳 球蛋白在70。C时就很快变性。 3．4 提高蛋白质的营养价值 有研究表明，二肽 6一( 一谷氨酰基)一赖氨酸 可代替氨基酸促进白鼠生长。大鼠插管法实验表 明，谷醇溶蛋白与赖氨酸的交联产物可被消化，并可 在肠内吸收，它在管腔内被分解为谷氨酸基一赖氨 酸进入血液，在肾脏中分解为赖氨酸和谷氨酸。 Fink(1988)发现，人体中也存在一种可水解 6一 ( 一谷氨酰基)一赖氨酸的酶，因此，可将限制性氨 基酸交联到某种蛋白质上，以提高此种蛋白质的营 养价值，这种方法与添加游离的氨基酸相比有两个 优点：一可以提高氨基酸的稳定性，增强蛋白质的功 能性；二是赖氨酸与蛋白质交联后，可以避免发生美 拉德反应，防止营养成分损失。但除蛋白质之外的 其余游离氨基酸均不能作为谷氨酰胺转胺酶的底 物，此时可用含所需氨基酸的肽链做底物。 3．5 改善肉制品口感、风味等特性 谷氨酰胺转胺酶可使肉中的许多蛋白质交联， 故在肉制品重组过程中谷氨酰胺转胺酶可以发挥 重要作用。具体方法是将机械脱骨碎肉与纤维蛋 白原及谷氨酰胺转胺酶在 1O。C下混合过夜，即可 得到重组后的整肉；或将碎肉与谷氨酰胺转胺酶、 面粉、奶粉等原料混合，经成型、蒸煮杀菌可生产汉 堡包、肉丸、烧麦等风味食品。在肉制品加工过程 中所产生的副产品如机械脱骨碎肉、胶原蛋白、血 R4 等均可用谷氨酰胺转胺酶加工再利用。在重组肉 制品中将各种非肉蛋白质交联到肉蛋白上，从而提 高肉制品的口感、风味、组织结构和营养性。交联 的蛋白质可以作为脂肪的替代物，生产低脂肉制 品。NOV0公司使用交联酪蛋白凝胶作为脂肪替 代物，应用到色拉米肠中替代 50％的脂肪。用谷 氨酰胺转胺酶处理可提高肉制品的颜色。 3．6 提高蛋白质的成膜性能 由于TGase可在一些蛋白质之间形成共价交 联，产生自我支持的网络结构，是制备可食性膜的 良好材料。用于食品包装，控制水分、氧气、二氧化 碳转移，防止脂肪氧化和挥发性风味物质损失，防 止食品表面污染。 在 Ca 和甘油存在下，5％的乳清蛋白于 pH 7．5的缓冲溶液中反应，通过 TGase的交联作用形 成乳清蛋白聚合物，干燥后制备成可食性膜。膜的 水分透过率与膜的厚度相关，甘油含量直接影响膜 的水分含量和抗破裂性能。由乳蛋白质形成的可 食性膜耐水耐热，可被蛋白酶消化。Venugopal等 人利用 TGase处理鱼肉蛋白后，可生成可食性的薄 膜，可直接用于水产品的包装和保藏，提高产品的 外观和货架期 ¨。 为了改善储藏的稳定性及控制内容物的释放， Park J等 ¨利用 MTGase交联蛋白质，选用 SPI为 壁材，包埋鱼油。这种方法制得的微胶囊具有对氧 有更高的稳定性和更低的水溶解性，能达到鱼油的 缓释 4 ‘结语 谷氨酰胺转胺酶作为一种新型的食品添加剂， 具有改善蛋白质食品结构、提高产品得率、提高原 料利用率、提高蛋白质营养价值等功能，在食品工 业中发挥着重要作用。随着对谷氨酰胺转胺酶研 究的进一步深入，对反应过程的精确控制，其在食 品工业中的应用必定具有更广阔的前景。 参考文献 1．Brian J B Wood[英]，徐岩．发酵食品微生物(第二版)．北 京 ：中国轻工业出版社，2001：238--241 2．王灼维和王璋．链霉菌生产谷氨酰胺转胺酶的发酵工艺条 件研究．食品工业科技，2003，24(9)：17—22 3．Yokoyama K．Nakamura N，Seguro K．Overproduction of micro— bial transglutaminase in Escherichia coli，in vitro refolding，and (下转88页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．5 酸味剂、甜味剂、甘氨酸分别为 0．35克、0．20克、 0．01克、0．2克。根据极差 R大小可知：这四个因 素对发酵辣椒风味影响的主要顺序为：酸味剂>鲜 味剂>>甜味剂 >甘氨酸。按照最佳配方调配原 料后与2号试样进行对比实验，发现两者风味比较 接近，但前者成本较低。所以最佳配方试制产品。 3．2 理化指标 3 产品质量 3．1 感官评定 由于原料本身颜色和脆度都很好，所以调味后 产品颜色鲜艳，有脆性，咸、酸、鲜、甜都适口，整个 口感柔和悠长。但缺乏发酵香味，有待在此基础上 进一步调配发酵香味。 表 5 调味后产品和传统家庭制作的发酵辣椒理化成分测定结果 参考文献 1．蔡育发．调味是风味的关键[J]．中国调味品，1998(9)： 3O一32． 2．毛羽扬，陈敏．成鲜味最佳配比效果的研究[J]．中国调味 品，2002，283(9)：35—38． 3．刘钟栋．食品添加剂原理及应用技术(M)．北京：中国轻 工业出版社 ，2000． 4．何文矫，罗奎．天然调味料——水解植物蛋白(HVP)[J]． 中国调味品，1998，(9)：4—5． 5．秦川，邓林胜，杨家远．调味品整体风味的解决方案[J]． 食品科技2002，(11)：41—42． 6．宁辉，廖国洪．肉制品的调香调味设计[J]．肉类研究， 2002，(4)：33一 ． 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