(naA59)存在于两种菌中,有6个型常见,基本弄清
了flaA型在美国的分布情况,有14株血清不能分型
的菌株可以用fbA分型。Mohran等[15]进一步作了
naA和flaB的PCR—RFLP分型,对59株临床分离的
埃及空肠弯曲菌和/或结肠弯曲菌的分型结果是:存
在14个flaA型和11个flaB型,虽然有一些变异性,
但大多菌株的flaA型与flaB型是相同的,也有的同
一组Lior血清型间存在着较大的遗传变异性。结果
还提示,从埃及分离的常见Lior血清组的鞭毛蛋白
基因比北美分离的变异性更大。
2.7 AFLP分型
ArtY(amplified—fragmentlengthpolymorphism),即
扩增片段长度多态性分析,是由Keygene发明的最
新、最有发展前途的一种分型方法【16J。方法是:用
两个限制性内切酶完全消化DNA,一个是4bp识别
位点,一个是6个bp识别位点。PCR引物是根据酶
切位点设计的,放射性或荧光标记,PCR产物在变性
聚丙烯酰胺凝胶分析,可以分离50~500bp的片段。
Duim等H7J用H/ridm、胁I两个内切酶和选择性扩
增的PCR引物建立AFLP方法,对分离自人和家禽
的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌进行分型,发现lo株来
自人空肠弯曲菌的带谱是不同的,而其他大多数与
来自家禽的弯曲菌是同类型菌。
随着生物技术的发展,空肠弯曲菌的检测从生
化检测到免疫学检测,再到基因诊断,为临床诊断和
食品安全控制带来了许多便利(特别是定量PCR检
垦处匡堂:煎缰瘟堂篮鎏痘堂坌堡至咝生!Q旦复垫鲞笠兰翅
测可以监督药物的疗效、提示病情的发展情况)。基
因分型将在全球分子流行病学研究中应用更广泛,
但各种分型方法的
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
化和统一化(所用的酶、电泳
条件和命名原则)、各个实验室分型数据的交流和全
球性的基因分型数据库都是迫切需要解决的。每种
分型方法都有各自的优点和缺点,把各种方法综合
起来分型,将使分辨力和分型率更高。空肠弯曲菌
的基因分型方法以16S或23SrDNA分型、flaA分型、
RAPD和AFLP的分型率和分辨力最佳,能很好地满
足流行病学调查的需要,其中AFLP自动化比较强,
有着更好的应用前景。
参考文献
1 DoehertyLeta1.LeftAVVlMicrobiol,1996;22(3):288—292
2 GonzaleretalI eta1.JainMic_n】biol,199r7;35(3):759~763
3 Houng删eta1.DiagnMicrobiolInfectDis,2001;40(1-2):1l~19
4 MetherellIAeta1.JainMicorbiol,1999,32(2):433~435
5 GrennanBeta1.Biotechniques,2001;30:608~610
6 WfmgeASeta1.ApplEnvironMicrobiol,1999;65(4):1636~1643
7 L啪JMeta1.JClinMicrobiol,2001;2227~2232
8 NogvaHKeta1.ApplEnvironMicrobiol,2000;66(9):4029~4036
9 wilsonDLeta1.JC1inMicrobiol,2000;38(11):3971~3978
10“ndLeta1.JClinMicrobiol,1996;34(4):892~896
1l RagirnbeaIlCeta1.JApplMicrobiol,1998;85:829~838
12 FryBNeta1.Microbiology,1998;144:2049~2061
13 Fi均群raldCeta1.JClinMicrobiol,1996;34:259~265
14 NachamkinJeta1.JainMicrobiol,1996;34:277~28l
15 MdaranZSeta1.JClinMicrobiol,1996;34:1216~1219
16 SavelkoulPHMet81.JClinMicrobiol,1999,37(10):3080~3091
17 DuimBeta1.ApplEnvironMicrobiol,1999;65(6):2369~2375
抗菌肽的分子生物学研究进展
苏州大学医学院病原生物学教研室(215007)周霞诸葛洪祥综述周洪福审校
摘要:抗菌肽是具有广谱杀菌、抑病毒、抑杀肿瘤细胞等作用的一类膜活性多肽,广泛存在于从细菌到哺乳
动物的生物界。本文就抗菌肽在天然免疫中的地位、抗菌作用机制、抗肿瘤作用机制等研究进展进行综述。
关键词:抗菌肽;抗癌作用;抗菌作用;基因重组
抗菌肽(antibacterialpeptide)又叫抗微生物肽
(antimicmbialpeptide)、抗生素肽(antibioticspeptide),
是由瑞典科学家BomanHG于1972年首先发现的,
在动物体液系统中具有广谱杀菌、抑病毒、抑杀肿瘤
细胞等作用的一类膜活性多肽。抗菌肽耐热,100。C
·310·
30分钟不破坏抗菌活性;不会诱导抗菌株的产生;
对原核生物细胞有很高的杀菌活性,而对真核生物
的正常细胞则无明显毒副作用。抗菌肽广泛存在于
从细菌到哺乳动物的生物界,是天然免疫的主要成
分,因而被称为“第二防御体系”或“第二免疫体系”。
万方数据
国外医学·流行病学传染病学分册2002年10月第29卷第5期
最近的研究发现,抗菌肽作为天然免疫的一部分在
抗菌、抗病毒及抑瘤方面具有重要的地位,有望成为
高效低毒的肽类新药。
1.抗菌肽在天然免疫中的地位
抗菌肽作为动物天然免疫的一个主要方面,对
动物的非获得性免疫具有特殊意义,它能通过对细
胞的分类识别而避免免疫自损,或通过对非宿主微
生物的特异性识别完成免疫反应,不需要经典的免
疫反应的复杂过程——免疫特异性和免疫记忆这两
大功能作为基础,使生物体能够在短时间内同时杀
灭两种或两种以上的入侵病原体。近来,人们开始
关注抗菌肽,发现抗菌肽在不同种属动物天然免疫
反应中具有重要的作用,抗菌肽的研究意义在于抗
菌肽与传统的抗生素不同,前者是在微生物体内由
基因编码,通过对前抗菌肽原逐步合成成为成熟的
有活性的肽。合成加工过程可分以下三步:(1)信号
肽酶切去信号肽形成肽骨架;(2)二肽酶去掉信号肽
与成熟肽间的一段前序列;(3)酰胺化酶去掉C端的
Gly而使C端酰胺化。植物同样具有这样的合成抗
菌肽的功能,并且被普遍认为植物抗真菌肽比动物
抗真菌肽具有更强的毒性和潜力。在昆虫体内,体
液产生的抗菌肽,如天蚕素和昆虫防御素,被认为是
昆虫抵御严重感染的主要物质,如:大肠杆菌(E.
coli)在果蝇体内是一种正常寄生的菌群,然而,如果
把大肠杆菌诱导的持续免疫状态用放线菌酮阻断,
这些无害菌群就会大量的繁殖并在24小时之内杀
死果蝇。同样,在樗蚕和天蚕的幼虫体内,由其他菌
种诱导的持续免疫,用放线菌素和放线菌酮阻断后
也出现相似的结果。显然,病原体诱导的抗菌肽对
于昆虫是抵抗细菌感染的关键因素。同时,抗菌肽
在昆虫体内也参与变态反应。在这个过程中,一些
动物及昆虫的内部器官被溶组织性的物质溶解和分
化,并释放肠道菌群毒素,从内部诱发感染,诱导天
蚕素和昆虫防御素mRNA的合成。可见,抗菌肽对
表皮细胞的天然免疫具有举足轻重的作用。在小牛
呼吸道上皮有一种被叫做“TAP”的j3一防御素表达;
在人小肠Paneth细胞中也有这种的表达。最近⋯I,
研究发现人皮肤中也含有分子量与肽相仿的抗菌因
子(A.BomanandS.Liden),正常菌群寄生在皮肤、口
腔粘膜、肠道和呼吸道等“可再生性器官”中,新的细
菌在不停地克隆繁殖,正是抗菌肽的持续释放控制
着正常菌群,使得正常菌群几乎一直保持在稳定状
态(而不是免疫球蛋白A的分泌或效应细胞的释
放)。更引人注目的是,抗菌肽具有抵御非正常菌群
之外的其他致病细菌的繁殖和抑杀肿瘤的功能。抗
菌肽的这一双重性,使人们更加关注抗菌肽的研究
意义。
2.抗菌肽的抗菌作用机制
目前比较清楚的是昆虫抗菌肽的作用机制,包
括细胞膜电势依赖通道的形成、抑制细胞呼吸、抑制
细胞外膜蛋白的合成、抑制细胞壁的形成等等。
人们普遍接受的是,抗菌肽在细胞膜上形成膜
通道进而改变细胞的内外环境使细胞死亡;抗菌肽
在水溶液中呈随机卷曲,由静电吸引而附于细菌的
表面,疏水性的基团插入细胞膜内改变其构象,亲水
基团处于膜外;通过脂质体膜经抗菌肽处理后的电
势和电流的变化判断出抗菌肽在膜上形成孔道。离
子通道的形成分为以下3个步骤:(1)抗菌肽分子通
过静电作用被吸附到膜表面;(2)抗菌肽分子的疏水
尾巴插入细胞膜;(3)抗菌肽分子的两性分子a一螺旋
插入膜内,多个抗菌肽分子共同作用形成离子通道。
但关于昆虫抗菌肽的作用机制研究仍有许多不
同的学说,如:(1)抗菌肽作用于细胞膜时,N一端的两
亲螺旋结合在膜表面,仅c一端的疏水螺旋插入膜中,
进而形成离子通道;(2)抗菌肽通过作用于膜蛋白,
引起蛋白质凝聚失活,细胞膜变性而形成离子通道;
(3)抗菌肽扮演离子泵的角色,它使细胞内K¨陕速
被析出,ATP含量迅速下降继而导致细胞死亡;(4)
孔道的形成、开启和关闭都依赖于膜的电势,只有当
膜的电势高于110mv时,孔道才能形成或处于开启
状态,这种孔道又被称为电势依赖通道(voltage—de—
pendentchannel)。最近,Lockey等【2]通过电镜直接观
察到抗菌肽细胞膜上造成孔道,为电势依赖通道的
形成提供了直接证据。Wieprecht等[3]贝4认为膜表面
通道的形成是一个热力学过程:一个PGLa膜的发热
过程和一个缓慢的吸热过程,这个吸热过程是在肽/
脂比例为17mmol/mol以上时诱导形成的,同时有膜
内物溢出现象的形成。Kragol等[4]研究发现抗菌肽
pyrrhocoricin能抑制DnakATP激酶的活性并阻止补
救蛋白的合成,从而干扰细菌热休克蛋白Dnak的合
成;Otvos等bJ的研究也发现抗菌肽与热休克蛋白间
通过DnaI【具有相互作用,杀菌作用过程中的首要步
骤是在抗菌肽介导的通过细菌脂多糖(LPS)侵入细
胞。一种叫做attacin的抗菌肽能干扰大肠杆菌细胞
·311·
万方数据
外膜蛋白Ompc、Ompf、Ompa及Lamb基因的转录,使
这些蛋白含量减少,从而抑制细胞外膜蛋白合成,导
致细胞膜通透性的增加,细菌的生长受到抑制。而
麻蝇毒素Ⅱ则能抑制细菌胞壁的形成,使细菌不能
维持正常的细胞形态而生长受阻,但对已经形成的
细胞壁元作用。Fehlbaum等【6J6则发现,thanatin在
O.3~O.6/mlolL-1时就对大肠杆菌表现出强烈的杀
菌作用,但当其浓度提高到70tanolL-1仍然检测不到
细胞内K+的泄露,表明thanatin不是通过改变细胞
膜通透性来杀菌的。当利用40/mlolL-1的thanatin处
理细菌时,1小时后可监测到细胞呼吸作用变弱,6
小时后呼吸完全停止。由此认为,thanatin是通过抑
制细胞呼吸作用来杀菌的。通过对抗菌肽影响大肠
杆菌超微结构的研究发现,抗菌肽加入后,早期可导
致细菌运动减慢,菌体大量聚集,运动停止,细胞表
面出现皱缩;随着作用时间的延长,细菌壁端部出现
孔洞,胞内出现许多不明深色颗粒,进一步整个细胞
壁表面出现许多不规则的孔洞,细胞壁破裂,细胞膜
损坏,特别两端较为敏感,可能与运动的鞭毛有关;
继而产生微管道,膜的通透性增加,深色颗粒及胞浆
内容物成囊状大量外泄,胞壁凹陷,菌体形成空泡;
最终细胞完全解体,崩解成碎片。
3.抗菌肽的抗肿瘤作用机制
抗菌肽(10ttg/mL)对正常哺乳动物细胞及昆虫
细胞作用的体外培养显示,连续48~72小时均无不
良影响,但对肿瘤细胞则有选择性杀伤作用。现已
证明
住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问
,昆虫抗菌肽及免疫血、淋巴对B4转化细胞、
K562细胞和U937细胞、白血病K562细胞及肺癌细
胞A549、艾氏腹水瘤细胞、宫颈癌细胞(HeLa细胞)、
直肠癌HR8340细胞、肝癌细胞BEL7402、EAC肉瘤、
S180肉瘤细胞及U14宫颈癌细胞等在体外实验中
均表现有明显杀伤作用。最近研究发现,抗菌肽和
免疫血、淋巴及纯化抗菌肽D对直肠癌和肝癌细胞
的杀伤作用呈剂量效应性;通过抗菌肽CM4组分对
离体癌细胞U937、HeLa细胞骨架及核骨架损伤作用
的扫描电镜观察发现,癌细胞核骨架断裂,部分凝聚
成团,结构不完整;细胞骨架由最初的完整微管系统
卷缩成不规则网架,甚至骨架散乱,断裂,萎缩成团
状,进一步作用可使癌细胞膜破裂,内容物外泄,最
终导致细胞死亡。可能作用机制有以下几点:
(1)用同位素产标记胸腺嘧啶核苷酸对细胞渗
入试验,发现抗菌肽能抑制DNA的合成,导致3H一
·312·
TdR渗入明显下降;抗菌肽处理区减缓乃至停止对
同位素标记物的渗入,提示抗菌肽能抑制癌细胞的
核酸代谢。
(2)钙离子螯合剂.Indo.I.AM能与癌细胞钙离子
螯合而产生特异性荧光,用Indo-I—AM作钙离子探
针,通过粘附细胞激光定量分析及筛选仪观察发现,
抗菌肽能使癌细胞钙离子迅速逸出细胞外,提示抗
菌肽能破坏癌细胞的钙离子通道。
(3)采用电子显微镜观察癌细胞超微结构的变
化,发现抗菌肽作用于宫颈癌细胞时,在30分钟内
致癌细胞的纤毛收缩,细胞膜破坏,线粒体及核糖体
膨胀而变形,核膜及核仁电子云减弱,最后癌细胞崩
溃而死亡。
现已有学者将具有协同作用的抗菌肽有效片段
融合以得到更高效的融合抗菌肽【7J,如将天蚕素A
的第1~8位氨基酸与蜂毒素的第l。12位氨基酸
进行融合组成新的杂交肽(hybridpeptideCA.ME),并
且应用三组肺癌细胞株进行抗癌活性检测。研究表
明,对融合基因抗菌肽进行优化改良,把第16、18和
19位的氨基酸分别疏水化成亮氨酸(h)或心磷脂
(val)、碱性赖氨酸(Lye),可得到抗肿瘤活性更强的
抗菌肽。
4.抗菌肽的研究展望
由于从天然资源中提取抗菌肽成本高、得率低、
工序繁琐,研究者都寄希望于通过基因工程技术生
产抗菌肽,以满足科研及临床前试验的需要。人工
合成基因可以参考文献
材料
关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料
中报道的肽序列,更换
氨基酸,进行优化设计。目前,抗菌肽分子设计的主
要策略是:改变抗菌肽两性分子的a.螺旋的氨基酸
组成,增强其螺旋度;将带电氨基酸引入抗菌肽片段
以增加其带电荷数;寻找氨基酸数目最少的片段肽,
以获得活性更高、抗菌谱更广的抗菌肽。近年来人
们还采用基因工程新技术,构建了按照人们需要设
计的自然界中没有的新型基因及表达自然界不存在
的新蛋白。其方法有两种,点突变技术和基因拼接
技术,在抗菌肽的研究工作中主要采用后者:根据需
要将具有协同效应的不同基因进行拼接。Boman
等【8J曾将天蚕素A和蜂毒肽的部分氨基酸片段融合
得到了杂合肽(CAM),大小虽为天蚕素A的40%,
却具有与其他抗菌肽相似或更强的抗菌抑瘤活性;
此后又将天蚕素A(ceeropinA)基因的前半部分与天
蚕素D(cecropinD)基因的后半部分融合,获得5倍
万方数据
垦处匿堂:逾缝瘟堂堡鎏瘗堂坌避2咝堡!Q旦筮垫鲞箜主塑
左右的A—D抗菌肽。1998年,l
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