nullnull 蛋白质与DNA的相互作用
刘兴汉
哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室null分类:
与单链RNA结合
与茎环结构结合
与双链DNA结合:普遍性结合
特异性结合null蛋白质与DNA结合的特性:
1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体,两个单体具有旋转对称性,与硷基的旋转对称吻合。
2.蛋白质和DNA的接触区只在DNA的一侧。
3.在结合过程中,蛋白质和DNA都有构像改变。
4.普遍性结合:蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团形成离子键。
5. 特异性结合:识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷基接触。null蛋白质与DNA的普遍性结合中DNA特点:
蛋白质与DNA主链骨架接触,大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。
与DNA硷基序列特异性无关
结构的匹配性:
旋转对称性
特定距离的相反电荷
形成氢键基团排布上的匹配
形成足够大的范德华力null1.蛋白质和DNA都存在0.7nm 的重复距离
DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是0.7nm。
β—折叠,N原子间距离是0.7nm
伸展β—折叠Cβ间距离是0.7nm
α—螺旋,Arg和Lys被另外三个残基隔开,带正电荷侧链的距离是0.7nm.
2.DNA对称性
平移对称:
GCATCT GCATCT
CGTAGA CGTAGA
null二重轴对称
GCATCT TCTACG
CGTAGA AGATGC
二重旋转对称
GCATCT AGATGC
CGTAGA TCTACG
旋转对称
GCATCT CGTACA
CGTAGA GCATGT
null蛋白质与DNA特异性结合中DNA特点:
大沟内存在特异性识别信息
氨基酸与碱基对共平面
氨基酸和碱基对之间形成氢键 nullnullnull
NNOHNNNHNNONHCOOCCNHHNHHHGluAgrHnull蛋白质与DNA普遍结合中蛋白质特点:
β-折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合
可能是通过识别小沟结构实现
1.富含脯氨酸和碱性氨基酸
组蛋白有重复的SPKK
Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg
PRGRP序列与A-T碱基对结合
KPRGRPK序列也能与小沟A-T结合
2.碱性螺旋
组蛋白H1C端57个氨基酸
Lys和Gly,Lys在螺旋两侧,Gly夹在中间
null3.蛋白磷酸化作用
SP X X: Ser磷酸化
TPKK: Tyr磷酸化
磷酸化后和DNA结合能力下降
磷酸化失去氢键null蛋白质与DNA特异性结合中蛋白质特点:
1.蛋白质多形成二聚体
nullHTH复合物
nullnull同源盒结构
null亮氨酸拉链结构NH2COOH碱性氨基酸Agr和Lys锌指结构锌指结构Agr和G形成氢键nullnull细胞核蛋白质的提取
收集细胞,洗去血清和培养基
裂解细胞:Triton X-100
NP-40
去胞浆成分
裂解细胞核:高浓度KCl :600mM
变更缓冲液浓度null快速抽提
裂解液: 提取液:
10mM HRPES 250mM Tris
1mM EDTA 60mM KCl
60mM KCl 1mM DTT
1mM DTT 1mM PMSF
1mM PMSF pH 7.9
0.5% NP-40
pH 7.9null 1X107细胞100ul裂解液、冰浴5分钟、离心沉淀用不含NP-40的裂解液洗一次100ul提取缓冲液干冰异丙醇速冻,反复冻融3次离心沉淀 —800C保存null 凝胶滞后试验
null1.蛋白质和DNA结合复合物半衰期短
电泳缓冲液低离子强度
凝胶的笼效应
2.探针以20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合,过大增加非特异性结合。
3.用竞争性抑制检测DNA与蛋白质结合的特异性
4.加3ug Poly(dI-dC)减少非特异性结合
5.超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用
6.只能确定结合,无法确定序列DNA足迹分析DNA足迹分析DNA足迹分析DNA足迹分析null1.DNAaseⅠ随机水解核苷酸磷酸二酯键
每一个DNA分子最好只切一次
2.蛋白质与DNA结合保护DNA不被切割
3.电泳用的是变性凝胶:
相差一个核苷酸DNA彼此分开
蛋白质从DNA分子上脱落
4.可确定与蛋白质结合的DNA序列
5.DNA序列是固定的null随机PCR随机PCR凝胶阻滞试验:蛋白质和DNA结不结合,
不能确定结合的序列
DNA足迹分析:蛋白质结合DNA的序列
不能确定序列硷基变化对
结合的影响
随机PCR:结合序列硷基变化对结合的影响
null寡核苷酸设计与合成:
1.AAGAATTC—NNNNNNNNN—GGATCCAA
2. 引物合成
3.
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
结合反应寡核苷酸的合成
4.电泳回收null探针标记:
合成的含随机序列的单链寡核苷酸
3‘引物
32PdCTP
dNTP(不包括dCTP)
Klenow酶
电泳纯化null凝胶阻滞试验纯化探针
1.蛋白质与标准结合寡核苷酸结合
蛋白质与随机寡核苷酸结合
电泳(样品隔开,防污染)
2.凝胶回收
3.酚、氯仿去蛋白
4.PCR(底物加32PdCTP)
5.PCR产物再做凝胶阻滞试验,反复纯化null特异结合序列的克隆和序列分析:
酶切随机核苷酸序列与质粒重组
用引物对质粒序列进行分析
N1 N2 N3 N4 N5
A 14/0.32 13/0.30 4/0.11 5/0.11 14/0.32
C 9/0.21 12/0.27 23/0.52 26/0.59 7/0.16
G 4/0.01 6/0.14 6/0.14 9/0.21 19/0.43
T 17/0.39 13/0.30 11/0.25 4/0.01 4/0.01
T/A A/T/C C C G/A
超过50%:确定不可替换
25-50%:两种硷基可替换
小于25%:没有硷基特异性
SouthWestern杂交试验SouthWestern杂交试验确定与DNA结合的蛋白质分子量
蛋白质进行SDS-Page
转移硝酸纤维素膜
与核酸探针杂交亲和层析纯化DNA结合蛋白亲和层析纯化DNA结合蛋白凝胶阻滞检查DNA能否和蛋白质结合
足迹法,测序确定DNA序列
合成DNA
制备亲和层析柱
蛋白过亲和柱纯化null 谢谢