产芽孢纤维素降解细菌XN_13菌株筛选及酶活力测定

纤维素材料是植物光合作用的最主要产物，是自 然界中存在量最大的一类可再生资源。全世界每年产 农作物秸秆近 2000亿 t，中国每年达 6亿 t以上[1]。秸 秆是纤维组分含量很高的农作物残留物，当前，世界各 国均在研究如何利用纤维素[2-4]。利用纤维素降解菌发 酵饲料是当前饲料业的一个发展方向，它可将纤维素 分解为牲畜可利用的糖，同时增加饲料中蛋白质的含 量。 近年来，在高效纤维素降解菌的筛选上多以霉菌 为主，因为其具有降解高效、酶活力高等特点，但其不 足之处在于不易将其制成菌剂或其菌剂不易保存，不 利于工业化生产。但是目前，在纤维素酶菌株的选育 上取得了很大的进步，由过去以霉菌为生产菌转到以 细菌为生产主体[5-9]，芽孢杆菌倍受欢迎，这不仅由于芽 孢杆菌的适应性强，生长pH、温度范围广，能分解多种 底物，产酶活性高，因此从菌剂的角度来说，芽孢杆菌 基金项目：河北省自然科学基金项目“棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化”（398152）。 第一作者简介：王全，男，1980年出生，河北衡水人，助教，硕士。从事微生物与生化药学研究。 通讯作者：朱宝成，1962年出生，教授，博士生导师。研究方向应用微生物学。通信地址：071001河北保定市河北农业大学生命科学学院制药工程 系，Tel：0312-7528258，E-mail：zhu2222@126.com。 收稿日期：2008-11-20，修回日期：2009-01-06。 产芽孢纤维素降解细菌XN-13菌株筛选及 酶活力测定 王 全，李术娜，李红亚，雷白时，陈 妍，张立静，朱宝成 （河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001） 摘 要：为筛选对纤维素具有降解作用的产芽孢细菌，以牛粪为原料分离到217株降解细菌，采用刚果红 平板法对其进行初筛，对其发酵液测定酶活进行复筛，其中XN-13具有显著的降解活性，酶活力达1700 U/ml。对XN-13进行了菌体形态、菌落特征的观察及一系列生理生化试验和16S rDNA的序列测定，结 合XN-13菌株的形态特征和生理生化特征综合考察，初步判断XN-13为一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。产纤维素酶芽孢杆菌的获得对菌剂的大工业生产及菌剂的商品化具有重要意义。 关键词：产芽孢；纤维素；降解菌株；鉴定；酶活力 中图分类号：S182 文献标识码：A Screening and Identification on Capable of Degrading Cellulose of Produce Spore Cellulose Decomposing Bacteria XN-13 Wang Quan, Li Shuna, Li Hongya, Lei Baishi, Chen Yan, Zhang Lijing, Zhu Baocheng (College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding Hebei 071001) Abstract: In order to screen degradation of strain to cellulose, more than 217 degrading strains were isolated from the cattle manure of different districts, and tested their identification to cellulose through primary screening and secondary screening by Congo red plate method. The XN-13 strain had strong identification capability against the cellulose, and its enzyme activity was 1700 U/ml. The strain would have a great value in the research about straw degradation and a good prospect in application. The mycelium shape and colony characteristic observation, a series of physiological and biochemistry experiments and determination of the sequence of 16S rDNA of the fungi had been done. XN-13 was identified as Bacillus subtilis. The obtained of a produce spore cellulose decomposing bacteria XN-13 is very important to industrialization and commodity of inocula. Key words: produce spore, cellulose, degrading strain, identification, enzyme activity assay 中国农学通报 2009,25(11):180-185 Chinese Agricultural Science Bulletin Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 的稳定性要比以霉菌作为制剂稳定的多。而且从饲料 添加剂角度考虑，有些芽孢杆菌本身可作为益生菌，其 通过调节肠道正常菌群平衡、产生营养物质、调节机体 免疫功能、产生多种酶系等促进动物生长，提高生产性 能 [10]。因此芽孢杆菌的获得既能得到比较稳定的菌 剂，便于工业及农业上的储藏，而且有利于大规模工业 化生产。 笔者从微生物丰富的牛粪中分离到多株能分解纤 维素的产芽孢菌株，通过测定CMC酶活复筛出5株对 天然秸秆纤维素有较强降解能力的产芽孢细菌菌株。 并对其中降解活性最高的菌株进行形态观察、生理生 化试验和 16 S rDNA的序列测定来确定其种属，进行 菌种的分类鉴定。通过对细菌的种属鉴定更加详细的 了解其生理生化性质，为细菌降解机理研究及后续的 生产应用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 时间与地点 试验于 2008年在河北农业大学生命科学学院制 药工程系微生物研究室进行。 1.2 材料 新鲜牛粪，取自河北农大牧场健康奶牛直肠或粪 便。 1.3 培养基 NA培养基、NB培养基、CMC-Na培养基、刚果红 纤维素钠培养基见《微生物学实验》[11]。生理生化鉴定 培养基及试剂见《常见细菌系统鉴定手册》[12]。 1.4 试剂 0.05 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液；3,5-二硝基水杨酸 显色液（DNS）；0.5%羧甲基纤维素钠溶液；0.2 mg/ml纤 维素酶；2 mol/L盐酸溶液；72%硫酸溶液；中性洗涤液。 1.5 方法 1.5.1 初筛 （1）取新鲜牛粪 10.0 g于试管中，在水浴锅内 80℃水浴10 min，杀死菌体。 （2）称取5.0 g处理过的牛粪，于150 ml NB培养基 中170 r/min，37℃培养48 h。将培养后的发酵液进行 梯度稀释，依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分 别取稀释到 10-4、10-5、10-6的发酵液 20~30 μl到刚果红 纤维素钠平板中，三角刮涂布，37℃恒温箱中倒置培 养48 h。 （3）观察平板，标记出圈的菌种、测量水解圈直径 并 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 试验结果。 1.5.2 复筛 初筛所得菌株在液体发酵培养基中进行发 酵，考察发酵代谢产物的降解活性。一方面按初筛方 法考察发酵上清液的产酶能力；一方面定量测定发酵 上清液酶活。 将初筛得到的菌株扩培，转接到NB培养基上，置 于 37℃恒温培养 24 h以活化菌株。将活化后的菌株 接种至复筛液体发酵培养液中，37 ℃静置培养 48 h 后，以10 000 r/min，4℃离心5 min，取上清液点样于刚 果红平板的微孔，每孔点样 100 μl。37℃避光培养 5 天后观察并记录脱色圈的有无及大小。 1.5.3 纤维素酶活力的测定 （1）CMC酶活力测定。酶活力（U/ml）=OD×H×N× 2×1000/30。是H—标准曲线系数，N—酶液稀释倍数， 2—换算成每毫升酶液，1000—葡萄糖毫克数换算成微 克数。 精确称取 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯无水葡萄糖100 mg，溶于蒸馏水 中，定容至 100 ml。将初筛的菌种分别接种于不含葡 萄糖的NB培养基中170 r/min，37℃培养48 h。 分别吸取各个菌种的发酵液 1 ml于 EP管中， 10 000 r/min离心10 min后上清液即为粗酶液。 在试管中加入 1.0 ml 0.5%羧甲基纤维素钠溶液， 1.0 ml 0.2 mg/ml纤维素酶液，于 50℃反应 30 min后， 加入DNS试剂终止反应，沸水浴5 min，于550 nm比色 并记录实验结果。以光密度为纵坐标，含糖量为横坐 标，绘制标准曲线。 （2）菌株降解能力测定。取 1.0000 g样品置于烧 杯中，加入 2.0 mol/L HCl，70 ml之后放入高压蒸汽灭 菌锅，100℃保温50 min。依次用95%乙醇、无水乙醇 和丙酮洗涤 2次（之前称量滤纸重量），将残渣连同漏 斗置于烘箱中，干燥至恒重减去滤纸重为W2。将漏斗 中残渣取出，置于烧杯中，加入72%硫酸，10 ml，20℃ 降解 4 h后，加入蒸馏水 90 ml过夜。次日，将样品抽 滤，残渣洗至 pH 6.5左右，将残渣连同漏斗置于烘箱 中，干燥至恒重减去滤纸重为W3。 测完后，用以下公式计算分别得到各组分的含量。 纤维素(%)=(W2-W3)/W2×100 纤维素降解率(%)=(对照秸秆中纤维素含量-处理 后秸秆含量)/对照秸秆纤维素含量×100 1.5.4 菌种的鉴定 将出圈的菌种分别挑至NA斜面中 于37℃恒温箱中培养24 h，置于4℃冰箱中保存。根 据菌株的菌落形态特征、菌体形态特征、革兰氏染色性 状、芽孢染色性状，有关生理生化鉴别试验，参照《常见 细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》进行属和 种的鉴定。 （1）菌种形态鉴定。菌株体形态观察：将复筛得到 的菌株进行 10倍梯度稀释，取 10-4、10-5梯度的稀释液 王全等：产芽孢纤维素降解细菌XN-13菌株筛选及酶活力测定 ·· 181 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 涂NA平板，37℃培养24 h得单菌落，观察记录菌落形 状和大小、边缘、 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面、隆起形状，透明度、菌落及培养 基的颜色等。另挑取斜面上 37℃培养 24 h的各个菌 株，参照东秀珠等的《常见细菌系统鉴定手册》上的方 法进行革兰氏染色，显微镜下观察其菌体形态。并进 行芽孢染色、鞭毛染色及异染粒观察等。 （2）生理生化鉴定。参照东秀珠等的《常见细菌系 统鉴定手册》对菌株进行生理生化实验。主要进行 H2S产生试验、吲哚试验、明胶液化试验、过氧化氢酶 （接触酶）试验、氨基酸脱羧酶试验、淀粉水解、V.P（乙 酰甲基甲醇）试验、M.R（甲基红，Methyl Red）试验、柠 檬酸盐利用、石蕊牛奶分解、糖、醇发酵、苯丙氨酸脱氨 酶、产氨试验、脲酶（尿素水解）试验、亚硝酸盐还原试 验、硝酸盐还原试验和荧光色素试验。 （3）DNA提取和 16S rDNA基因扩增。参考Kim 等和Rainey等的方法提取细菌总DNA。1%琼脂糖电 泳检测。 引物为通用引物[10]，正向引物为27F：5’-AGAGTTTG ATCCTGG CTCAG-3’，反 向 引 物 为 1495R：5 ’-CTACGGCTACCTTGTT ACGA-3’。 PCR反应体系：DNA（70 ng/μ l）模板 2 μ l；dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5 μ l；27F（20 μmol/L）1.5 μ l； 1495F（20 μmol/L）1.5 μl；10×ExTaq Buffer（Mg2+ pluse） 5 μl；ExTaq DNA聚合酶0.2 μl；补足ddH2O到50 μl。 PCR条件为：94 ℃预变性 3 min；然后 94 ℃变性 1 min、55℃退火1 min、72℃延伸3 min，共30个循环； 最后 72℃延伸 5 min。PCR产物经试剂盒纯化后，送 上海生工生物工程技术服务有限公司测序。 （4）16 S rDNA序列分析及系统发育树绘制。将 所测得的 16 S rDNA序列用BLAST软件与GenBank 数据库进行相似性分析，并与GenBank中的相近序列 在 Clustal X（1.8）程序包中进行多重序列匹配排列 （Multiple alignments）分析，最后形成一个多重序列匹 配排列阵，其中形成的缺口用横杠“-”填补，用 Neighbor-Joining法构建系统发育树。 2 结果与分析 2.1 降解纤维素芽孢杆菌的初筛 筛选具有水解圈的菌株，经筛选得到既产纤维素 酶又产芽孢的菌株17株，分别命名为XN-1至XN-15、 XH1-16、X2-14（表1）。 2.2 降解纤维素芽孢杆菌的复筛 对初筛菌株中水解圈直径较大的菌株进行液体发 酵，测定发酵60 h发酵上清液的水解圈大小，结果见表 2。 2.3 纤维素酶活力测定 综上所述，菌株 XN-13、XN-10、XN-9、X2-14、 XN-7酶活较高，复筛透明圈直径较大。选其中酶活力 较高的菌株XN-13进行了形态观察、生理生化试验和 16 S rDNA的序列测定来确定其种属，进行菌种的分 类鉴定（图1，表3）。 表1 降解纤维素芽孢杆菌的初筛 菌株 XN-1 XN-2 XN-3 XN-4 XN-5 XN-6 XN-7 XN-8 XN-9 XN-10 XN-11 XN-12 XN-13 XN15 XH1-16 X2-14 水解圈直径/mm 29.3±0.125 29.4±0.141 29.6±0.163 28.1±0.163 29.4±0.205 29.8±0.082 30.2±0.082 29.9±0.082 30.3±0.125 30.6±0.125 28.6±0.125 26.2±0.082 35.3±0.082 27.6±0.141 26.4±0.082 30.5±0.125 表2 降解纤维素芽孢杆菌的初筛 菌株 XN-7 XN-9 XN-10 XN-13 X2-14 水解圈直径/mm 32.4±0.216 31.3±0.082 30.6±0.082 36.5±0.125 31.3±0.082 y =2.259 x 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 葡萄糖/mg O D 5 5 0 图1 标准曲线 ·· 182 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 Administrator 铅笔 2.4 菌株降解能力测定结果 由表4可知，所筛菌株的降解能力较强，处理4天 后纤维素降解率在11.02%。处理8天后纤维素降解率 在 13.8%。由于取样并不能很均匀（有些秸秆叶子较 多，有些秸秆较多），导致实验数据会有偏差，纤维素含 量所测结果并不十分精密。 2.5 菌株XN-13菌种鉴定结果 2.5.1 高活性XN-13菌株形态及生理生化特征 菌落 特征：根据NA培养基上生长的菌株XN-13的菌落形 态，初步判断其为细菌菌落，培养24 h的菌落为不透明 的暗黄色，呈近圆形，边缘不整齐，表面有皱摺，中间有 突起（图2）。 菌体形态特征：供试菌株XN-13经染色后置于光 学显微镜下观察，菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性，菌 体长约 3.1 μm，宽约 0.9 μm，芽孢呈椭圆形中生，不膨 大，长约 2.0 μm，宽约 0.9 μm。生理生化试验结果：具 体的试验结果见表5。 将菌株XN-13形态及生理生化特征与《常见细菌 系统鉴定手册》中相应属、种进行对照，其与芽孢杆菌 属的典型特征基本一致（表 6），初步鉴定菌株XN-13 属于芽孢杆菌属（Bacillus）。 表3 复筛测定的酶活结果 菌株 XN-1 XN-2 XN-3 XN-4 XN-5 XN-6 XN-7 XN-8 XN-9 XN-10 XN-11 XN-12 XN-13 XN15 XH1-16 X2-14 酶活力/(U/ml) 1132.33 1150.40 1201.59 996.81 1183.52 1228.70 1267.84 1237.73 1306.99 1319.04 1084.14 584.23 1677.41 840.21 764.92 1310.01 表4 菌株降解能力测定结果 4天后降解率/% 11.02 8天后降解率/% 13.8 8天后生物量/(活菌计数×1010个) 10.375 表5 菌株XN-13的生理生化特征 注：“+”表示阳性，“–”表示阴性，以加号多少表示菌株活性的强弱。 项目 V.P 试验 酪素水解试验 硝酸盐还原试验 吲哚试验 淀粉水解试验 过氧化氢酶试验 硫化氢产气试验 葡萄糖发酵试验 甘露醇发酵试验 柠檬酸盐试验 甲基红试验 脲酶试验 明胶液化试验 纤维素分解试验 试验结果 + + + - + + - + + + - + + + 项目 2%耐盐试验 5%耐盐试验 7%耐盐试验 10%耐盐试验 pH4.0肉汤试验 pH5.7肉汤试验 pH6.8肉汤试验 pH7.2肉汤试验 pH9.0肉汤试验 精氨酸脱羧酶试验 苯丙氨酸脱氨酶试验 丙二酸盐试验 3-酮基乳糖试验 试验结果 +++ ++ + + +++ +++ +++ +++ ++ - - - + 图2 XN-13的菌落形态 王全等：产芽孢纤维素降解细菌XN-13菌株筛选及酶活力测定 ·· 183 Administrator 铅笔 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 2.5.2 16S rDNA序列分析 将菌株XN-13的16S rDNA 序列与GenBank中所有已测定的原核生物 16S rDNA 序列进行比较，得到该菌株及相关菌株的进化距离并 构建了系统发育树，见图3。 序列号 BFAF004589 AB325583 AB363731 DQ993671 CP000002 DQ993673 AB363735 AJ276351 AB021198 AB245422 种名 Anoxybacillus flavithermus Bacillus amyloliquefaciens Bacillus atrophaeus Bacillus axarquiensis Bacillus licheniformis Bacillus malacitensis Bacillus mojavensis Bacillus subtilis Bacillus vallismortis Bacillus velezensis 菌种号 DSM 2641 NBRC 15535 NBRC 15539 LMG 22476 ATCC 14580 LMG 22477 NBRC 15718 DSM 10 DSM 11031 LMG 22478 相似性/% 89.06 99.20 99.20 99.73 98.02 99.71 99.64 99.93 99.71 99.20 表6 菌株XN-13与参比菌株的16S rDNA序列相似性 0.01 CP000002 Bacillus licheniformis BFAF004589AnoxybacillusflavithermusAB363731 Bacillus atrophaeus AB245422 Bacillus velezensisAB021198 Bacillus vallismortis AB325583 Bacillus amyloliquefaciensAB363735 Bacillus mojavensisDQ993671 Bacillus axarquiensisDQ993673 Bacillus malacitensis XN-13AJ276351 Bacillus subtilis 100 40 52 2439 59 59 50 0.01 CP000002 Bacillus licheniformis BFAF004589AnoxybacillusflavithermusAB363731 Bacillus atrophaeus AB245422 Bacillus velezensisAB021198 Bacillus vallismortis AB325583 Bacillus amyloliquefaciensAB363735 Bacillus mojavensisDQ993671 Bacillus axarquiensisDQ993673 Bacillus malacitensis XN-13AJ276351 Bacillus subtilis 0.01 CP000002 Bacillus licheniformis BFAF004589AnoxybacillusflavithermusAB363731 Bacillus atrophaeus AB245422 Bacillus velezensisAB021198 Bacillus vallismortis AB325583 Bacillus amyloliquefaciensAB363735 Bacillus mojavensisDQ993671 Bacillus axarquiensisDQ993673 Bacillus malacitensis XN-13AJ276351 Bacillus subtilis 100 40 52 2439 59 59 50 图3 菌株XN-13及相关菌株的系统发育树 0.01 由以上结果可知，与菌株XN-13的 16 S rDNA序 列同源相似性最高的 9株标准菌株均属于芽孢杆菌 属，其中有8株与菌株XN-13的16S rDNA序列相应的 同源相似度高于 99%，仅地衣芽孢杆菌与菌株XN-13 序列的同源相似度较低，但也达到了98%以上，因此可 初步判断菌株XN-13属于芽胞杆菌属。同时，由于供 试菌株XN-13与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的标 准菌株DSM 10的16 S rDNA序列的同源相似性最高， 达 99.93%，另外，其形态特征及生理生化特性也与枯 草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）相应的典型特征基本一 致，因此，综合以上试验结果，鉴定菌株XN-13为一株 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 3 讨论 试验中虽然复筛到 5株活性比较高的菌株，但是 某些初筛活性很高的菌株进入复筛后，其降解活性明 显降低，甚至消失，这可能是由于降解机制不同，或者 是发酵条件不合适所导致的，可以换其他培养基或将 培养基优化后再试，估计还可以获得降解效果不错的 菌株。事实也证明了适当改变培养基配方时，以前降 解活性较弱的菌株其降解活性有明显提高，这也表明 发酵条件对降解物质的产生具有重要影响。 秸秆纤维素和木质素的生物降解是作为秸秆发酵 饲料最有前景的方法之一，在秸秆回收利用上最大幅 度的增加了农作物的利用率，提高农业生产的经济效 应和社会效益方面具有重大意义。另外，试验所用菌 株来源于牛粪，系动物的肠道菌，对饲料的后续饲喂提 供了安全保障。目前，秸秆降解所涉及的芽孢杆菌种 类主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilies）、嗜碱芽孢 杆菌（Alkaliphlic Bacillus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）等[4,13-14]。因此，笔者主要是针对产芽孢细 菌进行筛选，这样可以增加试验成功的几率，也可以使 试验成果更便捷的进行农业生产应用。当然，试验虽 ·· 184 然筛选出纤维素酶活力较高，降解纤维素能力较强的 枯草芽孢杆菌XN-13，但是离实际应用还有一段距离， 还需要对很多的内容进行进一步研究。比如：发酵条 件的优化、产芽孢条件的优化、降解机制研究和用基因 工程方法构建、诱变产生更高效的降解菌株等多方面 的研究。 参考文献 [1] 顿宝庆,吴薇,王旭静,等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分 离与鉴定[J].中国农业科技导报,2008,10(1):113-117 [2] Katharine S. 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