一个PCR反应过程分为很多的步骤，同时也受到很多因素的影响，可以分为内部因素和外部因素，内部因素是指正常试剂体系中的成分，外部因素是指环境或者样本带入的因素。体系内部因素引物：引物是整个PCR体系最重要的部分，也是决定一个PCR反应特异性的关键，引物在
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
时要遵守一定的原则（长度、扩增跨度、碱基等）。酶及其浓度：目前有两种TaqDNA聚合酶，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠杆菌合成的基因
工程
路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理
酶，酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5，正常情况下4种dNTP的浓度应该相等，如果其中某一种过高就会引起错配，浓度过低又会引起PCR产物的产量。模板核酸（靶标）：模板核酸的量和纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，对于RNA模板更要注意RNA的降解。Mg2浓度：主要影响PCR扩增的特异性和产量，一般要对应dNTP的浓度。Mg2浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。温度与时间的设置：PCR原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点，也就是变性温度与时间、退火（复性）温度与时间、延伸温度与时间。循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般温度循环次数在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量就越多。体系外部因素oSDS:离子去污剂，0.01%即可完全抑制PCR反应，0.005%可显著降低产量o苯酚:0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%可显著降低产量o乙醇:大于1%的浓度可抑制PCR反应，但在某些体系里又能增加产量o异丙醇:抑制作用比乙醇稍强o乙酸钠:大于5mM时抑制PCR反应o氯化钠:大于25mM时抑制PCR反应（生理盐水无影响）oEDTA:0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物o血红素（heme）-来源：血液，大于1mg/ml抑制PCR反应o氯高铁血红素（hemin）：大于0.1ng/μl抑制PCR反应o丹宁酸（tannicacids）：大于0.1ng/μl抑制PCR反应o肝素：大于0.15IU/ml抑制PCR反应o尿素-来源：尿，大于20mM时产生抑制o腐殖质-来源：土壤，植物材料，自然界水o植物多糖-来源：粪便，植物多糖o聚苯乙烯，聚丙烯-来源：紫外线照射塑料管o胆酸盐-来源：粪便o胶原质-来源：组织o靛青染料-来源：粗斜纹棉布，牛仔裤o蛋白酶-来源：牛奶o钙离子-来源：牛奶，骨头o铁离子-来源：血液o二甲苯胺o溴酚兰胆红素（bilirubin）o其他抑制剂除上述抑制剂外，还存在一定的PCR增强剂，比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG、亚精胺和单链DNA结合蛋白等，但是在高浓度情况下，也会对PCR产生抑制，因此如何采用增强剂消除抑制剂的影响，采用多少的浓度对结果都存在很大的影响。临床PCR常见问题1假阳性问题方法学问题：靶基因序列特异性、引物错配、非特异性扩增污染问题：样本污染、产物污染、产物污染解决办法：严格区分试验区域及人员培训，使用UNG技术2假阴性问题问题来源：试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素解决办法：设置阳性对照监测试剂问题降低操作难度，提高操作人员水平室内质控、室间质控监控使用抗干扰能力强的试剂提取样本
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