发酵过程中噬菌体感染问题

发酵过程中噬菌体感染问题 1 噬菌体 噬菌体是侵染细菌的微生物病毒，广泛分布于自然界中。在生产中见到的噬菌体为蝌蚪形，直径约0.1um，其形态在显微镜下看不见，通过电子显微镜放大9×104倍后才能看见。故在生产中平时对噬菌体看不见摸不着，无形之中增加了对其了解和预防的难度。 2 噬菌体的主要特性 2.1专一的寄生性。噬菌体只能在专一的宿主细胞中生长繁殖，只能在活的、处于繁殖阶段的细胞中生长繁殖，不能脱离宿生而自行生长繁殖。如果不同菌株的亲缘关系比较近，那么此菌株也是会感染的，特别是针对长期生产同一产品的发酵工厂要特别注意，在换新菌株之前必须了解其背景。 2.2不耐热性。游离的噬菌体在45℃条件下10min就可使其失活。 2.3不耐药性。直接在噬菌体上喷洒1%新洁尔灭、75%酒精、1%双氧水、5%的甲醛等都可使其失活。 3 感染噬菌体后的现象 噬菌体分烈性噬菌体和温和性噬菌体。温和性噬菌体由于其潜在的危害性大，有时候感染了，但不爆发，为以后的大面积爆发埋下了隐患。在从事发酵工作时就遇到，车间周围环境恶化的已经相当厉害，仅一个星期中上的罐中有75%罐都爆发了噬菌体，除了一罐以外，且 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 观中基本看不出染噬菌体的现象，而电镜观察是能看到噬菌体存在的。 感染后爆发的现象有： 3.1发酵液光密度开始上升，而后下降。但有时也不上升，当把1%的噬菌体人为的接入罐中，光密度始终处于最低位 3.2 pH逐渐上升，一般升到7.5，不再下降 3.3耗糖、氨缓慢或停止 3.4 OD回升 3.5泡沫大、料液略黏 3.6镜检时发现菌体减少，发胖，革兰氏染色后呈现红色碎片。严重时，可出现拉丝或网状，或呈鱼刺状，几乎看不到完整菌体。 3.7用含有噬菌体的发酵液点在平板上能看到噬菌斑 4 噬菌体的预防 4.1五大误区 4.1.1精度为0.01um的空气过滤器能阻拦噬菌体空气。过滤器中的0.01um的精度不是单指膜的精度，他是把布朗运动、撞击等拦截都计算在内的，故0.01um只是个相对精度，实际上膜的绝对精度在0.2um左右，故0.01um的空气过滤器可以挡住一部分噬菌体，但不能完全挡住。用过滤器的洗脱液经电镜观察，可以看到噬菌体的存在。 4.1.2噬菌体不耐热，65℃以上的温度可杀死噬菌体。我们所说的热灭菌是指达到一定的温度并维持一定的时间，使微生物致死的过程，可在实际生产中我们经常会遇到温度达到了使噬菌体致死的温度，可是却杀不死噬菌体，主要原因在于维持时间不够。这就很容易解释为什么空气在进罐前就已经加热到70℃，可噬菌体仍然能活着进罐。 4.1.3噬菌体对药物敏感。甲醛等消毒剂可杀死噬菌体原理同上，虽然药的浓度和剂量足够，可是如果维持时间不够仍起到不杀菌效果。用5%的甲醛对全厂区喷洒，而后在环境中取样测定，仍有很多活噬菌体。 4.1.4预防噬菌体是发酵车间的事情，与其他车间无关。噬菌体的防治是要上下齐动手，人人都参于。发酵要做好是需要各部门配合且长期坚持下去。 4.1.5生产正常时，对噬菌体的警惕可以放松一点了。对于噬菌体的防治，我们要做到年年防、月月防、日日防、时时防，至少每月召开一次关于噬菌体的分析会，每年召开一次噬菌体的总结会。 4.2预防措施 4.2.1活菌体的排放是噬菌体发生发展的首要条件，故如何控制活菌体的排放成为噬菌体预防的关键所在。 4.2.1.1每次上罐前对发酵罐进行空气试漏处理，防止由于设备原因造成话菌的外泄和噬菌体的进入。 4.2.1.2在接完种后，必须对残余种子液、接种瓶、种子罐及其连接管道附件等用蒸汽或药物消毒，没经过灭活处理的种子液不得排入污水池。 4.2.1.3在发酵过程中，需要知道细菌的生长情况，要求定时取样对发酵液进行检测分析。取样最好在无风的条件下进行，取样口下方需设一个装有碱液（pH≥11）的容器，除了加盖取样瓶中的料液外，其余料液必须全部进入该碱容器，切勿喷洒或直接进入下水道。取完样后，要用消毒水对取样者的手、取样瓶、装碱容器和以取样品为中心的上下左右1m的空间进行立体的喷洒；取样瓶需装在盛有消毒水的容器中直到化验室。 4.2.1.4化验室检测的对象就是带有活菌的料液，检测完pH后的电极需先用新洁尔灭冲洗，冲洗水入pH≥11的碱桶中；测OD时，移取原液的移液管或移液枪头须入碱水浸泡，比色管、比色器皿用新洁尔灭清洗浸泡30min后才可继续使用；离心管用新洁尔灭清洗浸泡30min后才可继续使用，且离心后固相及其清洗水须入碱桶中，凡是与料液有直接接触的液体废弃物须入碱桶，严禁直接排入下水池；凡是与料液有直接接触的固体废弃物须有pH≥11碱水浸泡2h后方可废弃。 4.1.2.5在发酵罐运行过程中有大量的尾气要外排，而这尾气中就含有活菌体，故尾气需经过蒸汽加热、热水处理和末端处理并且要排到远离车间100m以上的车间下风口位置。 4.2.1.6在放罐时，就是把大量的菌体排到下游，故对于放罐料液需要进行加热（70℃10min）和调酸（pH2～3）处理。 4.2.2如果在活菌的控制上做得比较好了，但仍避免不了有微量的活菌外泄，那就通过切断噬菌体与发酵液的接触来预防噬菌体的污染。 4.2.2.1提高吸风口高度，离地面每提高10m，空气中的含菌量可减少一个数量级。故吸风口高度越高越好，建议最低高度需超过发酵车间楼顶高度10m。 4.2.2.2在空压机进口前加装5um的过滤器，可以过滤掉很大一部分杂菌。 4.2.2.3加强环境消毒 车间内部用漂白水和新洁尔灭轮流对所有地面角落进行喷洒，定点放置固体二氧化碳，使车间内部能闻到淡淡的药味。每天早晚一次对车间地沟用漂白粉消毒，保持地沟内清洁无积水。车间周围用ClO2、漂白粉每天喷洒2次。 4.2.2.4加强普查力度 定期（3天1次）对车间内部和车间周围环境中的杂菌含量进行普查统计，重点部位要求每天普查，对测得不合格的区域进行重点消毒，并且分析杂菌的来源。每月1次选择有代表性的样品灭活后用电镜复检。 4.2.2.5加强对蛇管的检查力度。特别是弯头和焊接部分，极易受到料液的腐蚀而穿孔。蛇管中循环水的压力一般大于罐内压力，不管穿孔多少，水中的噬菌体会源源不断的进入发酵罐中，车间对蛇管3年来的4400m管道480只弯头及其连接管道的渗漏部位和数量统计如下： 可见在所有的漏点中，弯头渗漏的比例达到了88％，需特别引起重视。 5感染噬菌体后的处理办法 当发酵罐上出现噬菌体的典型现象后，一般说来是车间周围环境污染的相当厉害了。此时切忌不要多上罐，因为罐上得越多，周围环境污染更厉害。最好是减产或停产一个星期。 5.1发酵罐如果在20h感染噬菌体，那么立即加热到70℃维持10min后转到另外一个空消好的罐中，进行补种后重新发酵。如果在20h后感染的话，能产多少酸就让它产多少酸，如果不产酸的话就120℃，30min处理，排入污水池。 5.2感染噬菌体后的发酵罐及其相关联的系统都要经过处理： 5.2.1发酵罐要经过空消121℃，30min→5%甲醛100℃，4h→4%碱水100℃，4h→空消121℃，30min处理 5.2.2所有与罐体直接相连的阀门拆下来肢解后用4%碱水浸泡4h，然后组装好试压（0.8MPa的压缩空气）不漏后待用。 5.2.3物料管道用5%甲醛熏蒸4h，然后用4%热碱水浸泡30min以上，用清水清洗干净备用。 5.2.4移种管道用5%甲醛熏蒸4h，煮罐后的碱水通过移种管道排出，再用蒸汽消毒1h，要求每个排污阀都要微开，确保有水或汽排出。 5.2.5把补料罐先清空，补料管道用5%甲醛熏蒸4h，煮罐后的碱水通过移种管道排出，再用蒸汽消毒1h，要求每个排污阀都要微开，确保有水或汽排出。 5.2.6放料管道用5%甲醛熏蒸4h，煮罐后的碱水通过放料管道排出，再用蒸汽消毒1h 5.2.7空气总管用5%甲醛熏蒸4h，要求每个支路都要消到，再用蒸汽冲刷3h，最后用空气吹干。 5.2.8配料槽储料槽等用4%热碱水浸泡4h。 5.2.9取样瓶取样篮等用消毒水或碱水浸泡。 5.2.10空气过滤器重消吹干后备用。要用坚决、彻底的态度来对待噬菌体，宁可做过头也不能少做或不做。 5.3立即召开车间会议，探讨工艺管线等有无缺陷，如果存在立即整改 5.4立即制定相应的卫生和环境消毒策略，并予以执行。 总之，随着科技的进步，人类对噬菌体研究的深入，今后将会有更多有效的措施用于工业噬菌体的防治，确保发酵生产的正常运行。