null实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数一、实验目的
1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；
2、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别；
3、明确血细胞计数板计数的原理，以及使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数二、实验原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，一般呈（卵）圆形，圆柱形或柠檬形。其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖，有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。
假菌丝
真菌丝实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数二、实验原理
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型为蓝色，还原型为无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或者淡蓝色，借此可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数二、实验原理
显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的、具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。该方法的优点是菌种亲眼见、省时又省钱；缺点是死活两相汇，杂菌不能辨、菌丝不能计。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数二、实验原理
本实验以最常用的血细胞计数板为例，对显微镜计数法具体操作方法进行介绍。
血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上有4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一短横槽隔成2半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数二、实验原理
计数室的刻度一般有两种
规格
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，一种是一个大方格分为25个中方格，每个中方格又分为16个小方格；另一种是一个大方格分为16个中方格，每个中方格分为25个小方格。总之，每一个大方格的小方格数为400个。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数二、实验原理
计数室的容积：
1mm（大方格的边长）×1mm（大方格的边长）×0.1mm（盖玻片与载玻片之间的厚度）=0.1mm3（10-4ml）
计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或者16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。
实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数二、实验原理
以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：
1ml菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50 000AB
以16个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：
1ml菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32 000AB实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数三、实验仪器与用具
超净工作台、接种环、酒精灯、火柴、试管架、显微镜、擦镜纸、双层瓶、载玻片、盖玻片、血细胞计数板、毛细滴管等
四、实验材料与试剂
酿酒酵母（S. cerevisiae）培养约2d的PDA斜面培养物；0.05%和0.1%的吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用碘液实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数五、实验操作
（一）美蓝浸片的观察
滴一滴0.05%/0.1%吕氏碱性美蓝到载玻片的中央→取菌→盖玻片→静置3min后镜检→染色0.5h再次观察→注意死细胞数量是否增加实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数五、实验操作
（二）水-碘液浸片的观察
载玻片中央加一小滴碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌放在水-碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数五、实验操作
（三）显微镜计数
1、菌悬液制备
将5ml的左右的生理盐水加到S.cerevisiae培养斜面上，无菌接种环在斜面上轻轻刮取。将制备的悬液倒入盛有5ml生理盐水和玻璃珠的三角烧瓶中，充分振荡使细胞分散，实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数五、实验操作
（三）显微镜计数
2、检查血球计数板
在加样前，应先对血细胞计数板的计数室进行镜检。若有污物，可用自来水冲洗，再用95%的乙醇棉球轻轻擦洗，然后用吸水纸吸干或用电吹风吹干。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数五、实验操作
（三）显微镜计数
3、加样品
将清洁干燥的血细胞计数板先盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，再用镊子轻压盖玻片，以免菌液过多将盖玻片顶起而改变了计数室的容积。加样后静置5min，使细胞自然沉降。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数五、实验操作
（三）显微镜计数
4、显微镜计数
一般样品稀释度
要求
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每小格内有5~10个菌体为宜，每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。
计数原则：位于菌格上的菌体一般只计上方和右边线上的；如遇酵母菌出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为2个菌体计数；计数一个样品要从2个计数室中得到的平均值来计算样品的含菌量。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数五、实验操作
（三）显微镜计数
5、清洗
使用完毕后，先用自来水冲洗血细胞计数板及盖玻片，再用95%的乙醇棉球清洗，吸水纸吸干后，放回盒中，以备下次使用。实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数实验七 酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数六、实验作业
1、将显微计数的结果记录于
表
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1中，A表示5个中方格中的总菌数，B表示菌液的稀释倍数。表1 显微计数结果
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