中华人民共和国国家标准
GB 4789.3—2010
食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
National food safety standard
Food microbiological examination: Enumeration of coliforms
中华人民共和国卫生部 发布
2010-03-26 发布 2010-06-01 实施
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GB 4789.3—2010
I
前 言
本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数》。
本标准与GB/T 4789.3-2008相比,主要修改如下:
——修改了标准的中英文名称;
——“第二法 大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU~150 CFU”;
——删除了“第三法 大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。
本标准的附录A、附录B为
规范
编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载
性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为:
——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。
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GB 4789.3—2010
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食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
1 范围
本标准
规定
关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定
了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的
方法
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。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义
2.1 大肠菌群 coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数 most probable number,MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和
材料
关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。
3.3 恒温水浴箱:46 ±1 ℃ ℃。
3.4 天平:感量 0.1 g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶:容量 500 mL。
3.9 无菌培养皿:直径 90 mm。
3.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
3.11 菌落计数器。
4 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose,LST)肉汤:见附录 A 中 A.1。
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4.2 煌绿乳糖胆盐(Brilliant Green Lactose Bile,BGLB)肉汤:见附录 A 中 A.2。
4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(Violet Red Bile Agar,VRBA):见附录 A 中 A.3。
4.4 磷酸盐缓冲液:见附录 A 中 A.4。
4.5 无菌生理盐水:见附录 A 中 A.5。
4.6 无菌 1 mol/L NaOH:见附录 A 中 A.6。
4.7 无菌 1 mol/L HCl:见附录 A 中 A.7。
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第一法 大肠菌群 MPN 计数法
5 检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品:称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,
8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋
中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min,制成 1:10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶
(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成 1:10 的样品匀液。
6.1.3 样品匀液的 pH 值应在 6.5~7.5 之间,必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。
36℃±1℃ 48h±2h
36℃±1℃ 48 h±2 h
检 样
25 g(mL)样品+225 mL 稀释液,均质
10 倍系列稀释
选择适宜 3 个连续稀释度的样品匀液,接种 LST 肉汤管
产 气 不产气
BGLB 肉汤
不产气 产 气
大肠菌群阳性 大肠菌群阴性
查 MPN 表
报告结果
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6.1.4 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液
或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌
吸管反复吹打,使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释
1 次,换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过 15 min。
6.2 初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3
管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1 mL,则用双料LST肉汤),36
℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察倒管内是否有气泡产生,24 h±2 h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续
培养至48 h±2 h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
6.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36 ℃±1
℃培养48 h±2 h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
6.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的
MPN值。
第二法 大肠菌群平板计数法
7 检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。
图2 大肠菌群平板计数法检验程序
8 操作步骤
检 样
25 g(mL)样品+225 mL 稀释液,均质
10 倍系列稀释
36℃±1℃
18h~24h
计数典型和可疑菌落
BGLB 肉汤
36℃±1℃
24h~48h
报告结果
选择 2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液,接种 VRBA 平板
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8.1 样品的稀释
按6.1进行。
8.2 平板计数
8.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL生理盐
水加入无菌平皿作空白对照。
8.2.2 及时将15 mL~20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心
旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平
板,置于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。
8.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为 0.5 mm 或更大。
8.4 证实试验
从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于 BGLB 肉汤管内,36 ℃±1 ℃
培养 24 h~48 h,观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
8.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g
(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取
其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105
CFU/g(mL)。
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附录A
(规范性附录)
培养基和试剂
A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
氯化钠 5.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75 g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75 g
月桂基硫酸钠 0.1 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.1.2 制法
将上述成分溶解于蒸馏水中,调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中,每管 10 mL。121 ℃高压
灭菌 15 min。
A.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤
A.2.1 成分
蛋白胨 10.0 g
乳糖 10.0 g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200 mL
0.1%煌绿水溶液 13.3 mL
蒸馏水 800 mL
pH 7.2±0.1
A.2.2 制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200 mL(将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL
蒸馏水中,调节pH至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975 mL,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL,
用蒸馏水补足到1 000 mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10 mL。121 ℃高压灭
菌15 min。
A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
A.3.1 成分
蛋白胨 7.0 g
酵母膏 3.0 g
乳糖 10.0 g
氯化钠 5.0 g
胆盐或3号胆盐 1.5 g
中性红 0.03 g
结晶紫 0.002 g
琼脂 15 g~18 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 7.4±0.1
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A.3.2 制法
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH。煮沸2 min,将培养基冷却至45 ℃~
50 ℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3 h。
A.4 磷酸盐缓冲液
A.4.1 成分
磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0 g
蒸馏水 500 mL
pH 7.2
A.4.2 制法
贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中,用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节
pH,用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。
稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃高压灭菌15 min。
A.5 无菌生理盐水
A.5.1 成分
氯化钠 8.5 g
蒸馏水 1 000 mL
A.5.2 制法
称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。
A.6 1 mol/L NaOH
A.6.1 成分
NaOH 40.0 g
蒸馏水 1000 mL
A.6.2 制法
称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。
A.7 1 mol/L HCl
A.7.1 成分
HCl 90 mL
蒸馏水 1 000 mL
A.7.2 制法
移取浓盐酸90 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,121 ℃高压灭菌15 min。
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附录B
(规范性附录)
大肠菌群最可能数(MPN)检索表
B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B.1。
表B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳性管数 95%可信限 阳性管数 95%可信限
0.10 0.01 0.001
MPN
下限 上限 0.10 0.01 0.001
MPN
下限 上限
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --
注 1:本表采用 3 个稀释度[0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和 0.001 g(mL)],每个稀释度接种 3 管。
注 2:表内所列检样量如改用 l g (mL)、0.1 g(mL)和 0.01 g(mL)时,表内数字应相应降低 10 倍;如改用 0.01
g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时,则表内数字应相应增高 10 倍,其余类推。
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