蚜虫基因组DNA提取方法的改进

蚜虫基因组 DNA 提取 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的改进 3 杨子祥 　陈晓鸣33 　冯 　颖 　缪迎春 (中国林业科学研究院资源昆虫研究所　云南 昆明　650224) Method improvement for extraction genomic DNA from aphids. YANG Zi2Xiang , CHEN Xiao2Ming33 , FENG Ying , MIAO Ying2Chun ( Research Institute of Resource Insects , Chinese Academy of Forestry , Kunming Yunnan 　 650224 , China) Abstract 　The traditional SDS method was modified for the isolation of the genomic DNA from aphids with small body and surface covered by exoskeleton. Compared with the traditional SDS method , this simple and effective method avoids grinding tissue and is suitable for the extraction of DNA from single aphid. Genomic DNA prepared by this new method is suitable for PCR amplification using RAPD random primers and sequencing primers. Key words 　aphid , genomic DNA , extraction , improvement 摘 　要 　蚜虫基因组 DNA 的提取是蚜虫分子生物学研究中的难点。参照动物基因组 DNA 的提取方法 , 根据蚜虫体型微小 ,体 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 有外骨骼的特点 ,对 SDS 法作了改进。改进的方法无需用组织捣碎棒破碎虫 体 ,操作简便。与现在常用的提取方法相比 ,改进的 SDS法能快速、有效地提取单头蚜虫的基因组 DNA , 适用于 RAPD 随机引物和测序引物的 PCR 扩增。 关键词 　蚜虫 ,基因组 DNA ,提取方法 ,改进 3 科技部基础性研究项目 (2000DEB100035) 。33通讯作者 收稿日期 :2005212227 ,修回日期 :2006201212 　　运用分子生物学技术从核酸水平研究昆虫 的分类和鉴定、生物型的识别、遗传多样性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 等 ,是现代昆虫分子系统学和昆虫遗传学的研 究热点之一 ,开展这类研究的基础工作是基因 组 DNA 的提取[1 ] 。在昆虫分子遗传学研究中 , 由于研究的 样本 保单样本pdf木马病毒样本下载上虞风机样本下载直线导轨样本下载电脑病毒样本下载 量较大 ,除了要获得质量和数 量合乎要求的 DNA 外 ,还需要提取方法简便易 行 ,容易掌握 ,成本较低[2 ] 。 蚜虫是一类分布广 ,寄主广泛 ,经济价值较 高的昆虫 ,世界上已知种类为 4 000 多种[3 ] ,我 国已报道的种类 1 000 余种[4 ] 。蚜虫大多数是 害虫 ,它们刺吸植物汁液 ,直接影响植物生长 , 同时间接传播病毒病害 ,造成农业上的损失 ,如 棉蚜 Aphis gossypii、麦长管蚜 Macrosiphum avenae 等 ;少数种类如五倍子蚜虫 (倍蚜) 是重要的资 源昆虫 ,具有较高的经济价值[5 ] 。蚜虫身体微 小 ,形态特征不显著 ,生活习性复杂 ,并具有多 型多态现象 ,在分类和鉴定、近缘种的识别等方 面 ,传统的研究方法往往难以发挥作用[6 ] 。分 子遗传标记具有稳定性高、受环境条件影响小 , 信息含量丰富等优点 ,非常适合于蚜虫的研 究[7 ] 。蚜虫基因组 DNA 的提取是开展蚜虫分 子遗传学研究的难点 ,Black 等采用了 SDS 法提 取蚜虫基因组 DNA 并用于 RAPD 扩增[8 ] ;杨效 文等在烟蚜 Myzus persicae (Sulzer) 的研究中采 用 KAC法提取烟蚜的 DNA[9 ] ;安瑞生等对 KAC 法做了改进[10 ] ;以后的蚜虫研究人员大多采用 这种方法[11 ] 。近十几年来 ,蚜虫分子生物学研 究有了较大的发展 ,但对蚜虫 DNA 提取方法进 行探索和比较的研究较少。 本试验尝试和比较了上述几种方法 ,并以 动物基因组DNA 的提取方法为基础[12 ] ,根据蚜 虫体型微小 ,体表有几丁质外骨骼的特点 ,对 SDS法作了改进 ,改进的方法无需用组织捣碎 棒破碎虫体 ,操作简便 ,能快速、有效地提取单 头和多头蚜虫的基因组 DNA。 ·088·　 昆虫知识 　Chinese Bulletin of Entomology 2006 43 (6) 1 　材料和方法 111 　材料的来源 供试倍蚜样品中除肚倍蚜采自陕西西乡 处 ,其余均采自四川蛾眉 (表 1) 。在野外采集 相隔 115 m 以上、接近成熟但尚未爆裂的倍子 , 带回室内打开 ,将孤雌胎生有翅或无翅成蚜转 移到 115 mL 离心管中 ,无水乙醇浸泡 , - 20 ℃ 保存。 表 1 　材料来源 (2004) 材料名称 采集时 间 (月) 虫态 (成蚜) 角倍蚜 Schlechtendalia chinensis (Bell) 10 　 有翅Π无翅 　 倍蛋蚜 S . peitan (Tsai et Tang) 8 　 有翅Π无翅 　 肚倍蚜 Kaburagia rhusicola Takagi 6 　 有翅Π无翅 　 肚倍枣铁亚种 K. rhusicola ensigallis (Tsai et Tang) 6 　 无翅 　 倍花蚜 Nurudea shiraii Matsumura 8 　 无翅 　 红小铁枣蚜 Meitanaphis elongallis Tsai et Tang 6 　 无翅 　 112 　主要仪器和试剂 基因公司 UVP GDS28000 凝胶成像分析系 统 (含 LabWork 410 图像分析软件分析 ) , MJ PTC2200 PCR 仪 , Hermle 台式高速离心机 , Beckman DU800 核酸蛋白质分析仪 , Beckman CEQ8000 DNA 测序仪 ,上海天能 ESP 300 电泳 仪。 蛋白酶 K(40 UΠmg ,Merck) , GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus ( Fermantas) ,λDNA (48 ,502 bp ,宝生物公司 TakaRa) , Tris 饱和酚 (天津灏 洋) , dNTP 和 Taq 酶 ( Promega) , 引物由上海 Sangon 合成 ,其余试剂为国产分析纯。 113 　基因组 DNA 提取 从浸泡液中取出蚜虫 ,置于无水乙醇、双蒸 水中依次漂洗 ,吸水纸吸干 ,然后按下列方法提 取。 11311 　SDS 法 :参照田英芳等的方法[13 ,14 ] ,部 分步骤有改动。将单个蚜虫转入 115μL 的离 心管中 ,加入 100μL 匀浆液 (按A 液∶B 液∶C液 = 8∶1∶1 配制。其中 A 液 : Tris2 Base 0105 molΠ L ,NaCl 011 molΠL , EDTA 011 molΠL ,pH = 716 ;B 液 :5 %的 SDS ; C 液 :2 mgΠmL 蛋白酶 K) ,用与 离心管配套的组织捣碎棒充分研磨 ,再加入 500μL 匀浆液。45 ℃水浴 1～3 h ,加入 600μL 的 Tris 饱和酚 ,混匀 ,7 000 rΠmin ,下同) 离心 10 min ,取上清液。加入 550μL 氯仿∶异戊醇 (24∶ 1) ,混匀 ,8 000 rΠmin 离心 10 min ,取上清液。加 入 1 000 μL 冷无水乙醇 (预置于 - 20 ℃) , - 20 ℃度冰箱内放置 30 min 以上 ;12 000 rΠmin 离心 10 min ,倾去上清液。加入 500μL 冷的 70 %乙醇 (预置于 - 7 ℃) , 12 000 转离心 10 min ,倾去上清液。自然干燥后 , 加入 20 μL ddH2O 溶解。 11312 　改进的 SDS 法 参照动物组织基因组DNA 提取方法[12 ] ,部 分步骤有改动。将单个蚜虫转入 115μL 的离 心管中 ,加入 100μL 匀浆液 (按A 液∶B 液∶C液 = 25∶3∶2 配制。其中 A 液 : Tris2 HCl 10 molΠL , NaCl 011 molΠL , EDTA 1 molΠL ,pH = 810 ;B 液 : 10 %的 SDS ;C液 :10 mgΠmL 蛋白酶 K) 。将灭过 菌的 1 mL 枪头在酒精灯上烧一下 ,用其对蚜虫 进行简单破碎。再加入 500μL 匀浆液 ,56 ℃水 浴 4 h。加入 600μL 的 Tris 饱和酚 ,在摇床上缓 慢摇晃 20 min 后 ,7 000 rΠmin 离心 10 min ,取上 清液。加入 600μL 氯仿∶异戊醇 (24∶1) ,在摇 床上缓慢摇晃 20 min 后 ,7 000 rΠmin 离心 10 min ,取上清液。加入 600μL 异丙醇 (预置于 - 20 ℃) ,混匀 , - 20 ℃度冰箱内放置 1 h 以上。12 000 rΠmin 离心 10 min ,倾去上清液。加入 600 μL 冷的 70 %乙醇 (预置于 - 7 ℃) ,12 000 rΠmin 离心 10 min ,倾去上清液。自然干燥后 ,加入 20 μL ddH2O 溶解。 11313　KAC 法 :参照安瑞生等的方法[11 ] 。将 单个蚜虫转入 115 mL 离心管中 ,加入 20μL 提 取液 A ( Tris2HCl 0105 molΠL ,NaCl 01025 molΠL , EDTA 01025 molΠL ,1 % SDS) ,放置于 - 20 ℃冰 箱 4 min 后取出 ,用牙签捣碎 ,再加入 100μL 提 取液 A。65 ℃水浴 45 min ,加入 120μL 提取液 ·188·2006 43 (6) 昆虫知识 　Chinese Bulletin of Entomology 　 B( KAC 3 molΠL ,pH = 712) ,冰上放置 1 h 以上 , 12 000 rΠmin 离心 10 min ,取上清液。加入 240 μL Tris 饱和酚 ,混匀 ,12 000 rΠmin 离心 10 min , 取上清液。加入 200μL 冷无水乙醇 (预置于 - 20 ℃) , - 20 ℃度冰箱内放置 1 h 以上。12 000 rΠmin 离心 15 min ,倾去上清液。加入 100μL 冷 的 70 %乙醇 (预置于 - 7 ℃) ,12 000 rΠmin 离心 10 min ,倾去上清液。自然干燥后 ,加入 20μL ddH2O 溶解。 114 　DNA 浓度和纯度检测 采用 1 %的琼脂糖 ,88 V (4 VΠcm) ,上样量 为每孔 210μL ,电泳 70 min ,0105 % EB 染色 ,紫 外灯下观察、照相和分析。用 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus 作为分子量的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,并用λDNA (50 ngΠμL)估算分子量大小。 用核 酸 蛋 白 质 分 析 仪 测 定 OD260 和 OD260Π280 。 115 　PCR 扩增 选用 RAPD 随机引物 S7 (5′2GGTGACGCAG2 3) 、S118 (5′2GAATCGGCCA23′) 和 EF1α、线粒体 CO Ⅱ基因测序引物对所提取的模板 DNA 分别 进行扩增。PCR 反应体系为 20μL ,其中含 1 × buffer ,215 mmolΠL MgCl2 ,015 mmolΠL dNTP ,2 U Taq 酶 ,66 ng 引物 ,1μL 模板 DNA ,加入 ddH2O 至 20μL。反应条件为 :94 ℃5 min ,后进行 40 个循环 ,即 94 ℃1 min、36 ℃1 min、72 ℃2 min , 最后于 72 ℃延伸 10 min ,保存于 4 ℃。 测序引物的反应体系同上 ,反应条件为 : 95 ℃4 min ,后进行 35 个循环 ,即 94 ℃ 1 min、 51 ℃1 min、72 ℃ 1 min ,最后于 72 ℃延伸 10 min ,保存于 4 ℃。 将扩增后的 DNA 在 115 %的琼脂糖凝胶上 电泳 ,上样量为每孔 210μL ,电压为 66 V (3 VΠ cm) ,时间为 90 min ,电泳缓冲液为 1 ×TBE。 0105 % EB 染色 ,紫外灯下观察、照相和分析。 用 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus 作为分子 量的标准。 2 　结果与分析 211 　不同方法提取基因组的检测结果 21111　SDS 法 : 5 种倍蚜均获得了 DNA ,DNA 电泳条带基本呈线形 ,但有时会在 DNA 带的前 面出现少量拖尾。与λDNA 对照 , DNA 分子量 大小约为 48 kb ,结构较为完整。核酸蛋白质分 析仪检测结果 :OD260Π280 介于 116～118 之间 ,可 见 DNA 内含有蛋白质、多糖等杂质 ,DNA 的浓 度因虫体的大小不同有较大差异 ,一般介于 25 ～100 ngΠμL ,平均浓度为 60 ngΠμL。 21112 　改进的 SDS 法 : 5 种倍蚜均获得了 DNA ,DNA 电泳条带基本呈线形 ,无明显拖尾 (图 1) 。与λDNA 对照 , DNA 分子量大小约为 48 kb ,结构较为完整。核酸蛋白质分析仪检测 结果 :OD260Π280介于 118～210 间 ,可见 DNA 内的 含有一定量的 RNA ,DNA 的浓度介于 20～50 ngΠμL 之间 ,平均浓度为 40 ngΠμL。RNA 对 PCR 扩增影响不大 ,如果想去除 RNA ,可在 DNA 溶 解液中加入 RNAase 处理。 图 1 　改进的 SDS法提取的 DNA 电泳图谱 M. 分子量标准　λ. λDNA(48 kb) 1～5. 不同倍蚜的总 DNA 21113 　KAC法 :DNA 电泳图谱没有聚成条带 , 有时出现少量拖尾 ,说明此法提取的 DNA 量很 少 ,杂质较多。核酸蛋白质分析仪检测结果 : OD260Π280介于 114～117 之间 ,表明 DNA 含量低 , 并且含有较多的蛋白质和酚 (表 2) 。 212 　PCR 扩增结果 21211 　RAPD 随机引物的 PCR 扩增 :用引物 S118 扩增 SDS 法提取的 DNA ,得到了丰富的多 ·288·　 昆虫知识 　Chinese Bulletin of Entomology 2006 43 (6) 　　　 表 2 　不同提取方法比较表 名称 破碎工具 DNA 平均浓度 ngΠμL OD260Π280 主要杂质 DNA 结构 PCR 效果 SDS法 组织捣碎棒 60 116～118 蛋白质、酚、RNA 较完整 好 改进 SDS法 枪头 40 118～210 RNA 较完整 很好 KAC法 牙签 很少 114～117 蛋白质、酚、RNA 不完整 差 态性条带 (图 2) 。用引物 S7 扩增改进的 SDS 法提取的 DNA ,来自同一克隆的 4 个肚倍蚜个 体得到了基本相同的条带 (图 3) ,其他 3 个种 的带型明显不同 ,可见用这种方法提取的 DNA 质量较好 ,扩增结果稳定。 KAC法提取的 DNA 没有扩增出稳定的条 带。 图 2 　引物 S7 的 RAPD 扩增图谱 1～5. 不同倍蚜的扩增图　CK. 阴性对照 图 3 　引物 S118 的 RAPD 扩增图谱 1～4. 肚倍蚜同一克隆的不同个体　5～7. 其他 3 个种 21212 　测序引物的 PCR 扩增 :用 EF1α和 CO Ⅱ 基因测序引物分别对 SDS 法和改进的 SDS 法 提取的 DNA 扩增 ,结果均出现了单一的目标条 带 (图 4 ,5) ,经过切胶、纯化后 ,测定 DNA 序列。 采用Blast 工具 (NCBI站点)对 DNA 序列进行检 索和同源性比较 ,结果显示所测片段正是所需 要的目标片段 ,可见这 2 种方法提取的 DNA 均 可用于测序引物的 PCR 扩增。 图 4 　EF1α测序引物扩增图谱 (SDS法 DNA) 　 图 5 　COⅡ测序引物扩增图谱 (改进的 SDS法 DNA) 　 ·388·2006 43 (6) 昆虫知识 　Chinese Bulletin of Entomology 　 3 　讨论 真核生物的 DNA 提取方法虽然很多 ,但其 原理和步骤基本相同 ,即 :破碎细胞 ,在 EDTA 存在的情况下 ,用蛋白酶 K消化细胞或组织 , 用去垢剂如 SDS 溶解细胞膜并使蛋白质变性 , 再用各种有机溶剂如酚、氯仿等抽提和纯化 DNA。其中破碎细胞是关键步骤 ,研磨是否充 分将直接影响 DNA 提取的量和纯度[15 ,16 ] ,对于 蚜虫而言 ,还需考虑如何破碎其外骨骼。 KAC法是将样品冰冻后用牙签捣碎 ,这对 于个体较小的倍蚜难度较大 ,提取过程需要冰 冻等步骤 ,操作较为繁琐。SDS 法采用组织捣 碎棒捣碎 ,确保了组织的充分破碎 ,但组织捣碎 棒的反复使用容易造成 DNA 的交叉污染 ,如果 使用一次性组织捣碎棒 ,又增加了成本。与上 述方法相比 ,改进的 SDS 法具有如下优点 : (1) 采用枪头破碎虫体 ,操作简便 ,成本较低 ,减少 了污染 ; (2) 适当增加 SDS 和蛋白酶 K的用量 , 确保对蚜虫组织的彻底消化 ; (3) 提高水浴温 度、延长水浴时间 ,提高了蛋白酶 K的活性 ,促 进 RNA 的分解 ; (4)可得到纯度更好的 DNA ,而 DNA 纯度是 PCR 扩增成功的关键因子。可见 : 改进的 SDS 法是一种较好的蚜虫基因组 DNA 提取方法 ,此方法经过适当改进后 ,也可适用于 其他动物组织的 DNA 提取[12 ] 。 参 　考 　文 　献 1 　张迎春 ,刘波 ,郑哲民 ,李力. 昆虫学报 ,2005 ,45 (5) :693～ 695. 2 　石晶 ,谢映平 ,薛皎亮 ,姚国亲. 昆虫知识 ,2005 ,42 (2) :207 ～211. 3 　张广学 ,钟铁森. 中国经济昆虫志 ,第 25 册 ,同翅目 ,蚜虫 类 (1) . 北京 :科学出版社 ,1983. 1～2 ,68～70. 4 　任珊珊 ,乔格侠 ,张广学. 动物分类学报 ,2003 ,28 (2) :221 ～227. 5 　张广学 ,乔格侠 ,钟铁森 ,张万玉. 中国动物志 (昆虫纲 14 卷 同翅目 纩蚜科 ,瘿绵蚜科) . 北京 :科学出版社 ,1999. 270～272. 6 　黄原 ,袁锋 ,顾晓军. 昆虫知识 ,1996 ,33 (5) :306～310. 7 　龚鹏 ,杨效文 ,谭声江 ,陈晓峰. 昆虫知识 , 2001 ,38 (2) :86 ～91. 8 　Black IVW. C. , DuTeau N. M. , Puterka G. J . , Nechols J . R. , Pettorini J . M. Bull . Entomol . Res . 1992 , 82 : 151～ 159. 9 　杨效文 ,张孝羲 ,陈晓峰. 植物保护学报 ,1999 ,26 (2) :147 ～152. 10 　安瑞生 ,谭声江 ,陈晓峰. 昆虫知识 ,2002 , 39 (4) : 311～ 312. 11 　张素方 ,程家安 ,杨效文. 昆虫学报 ,2002 , 45 (6) : 764～ 769. 12 　缪迎春. 云南大学硕士研究生论文 ,2005. 13 　田英芳 ,黄刚 ,郑哲民 ,魏朝明. 陕西师范大学学报 (自然 科学版) ,1999 ,27 (4) :82～84. 14 　杨子祥 ,冯颖 ,陈晓鸣. 林业科学研究 ,2005 ,18 (5) :641～ 643. 15 　徐广 ,郭予元 ,梁革梅 ,张杰. 昆虫知识 ,2000 ,37 (3) :177～ 178. 16 　萨姆布鲁克 J . ,拉塞尔 (著) D. W. , 黄培堂等 (译) . 分子 克隆实验指南 (第 3 版) . 北京 :科学出版社 ,2002. 463～ 469. 封面照片 琥珀中最古老的蜜蜂化石 新华社电 　美国科学家在 2006 年 10 月 27 日《科学》杂志上报告说 ,他们在东南亚的一块琥珀中发现了距今已 有 1 亿年的蜜蜂化石 ,这是迄今发现的最古老的蜜蜂化石。 乔治·波伊纳尔等在本期简报中报告的这块琥珀发现于缅甸北部胡冈谷地的一处矿山中 ,里面困着 1 只蜜蜂 , 琥珀所在的地层经鉴定形成于约 1 亿年前的白垩纪早期。其他已知的蜜蜂化石比这次发现的要晚 3 500～4 500 万 年。这种名为 Melittosphex burmensis 的蜜蜂很小 ,只有 2195 mm ,而现代蜜蜂体长通常在 10 mm以上 ,但是它们表明 , 现今蜜蜂所具有的许多特征在 1 亿年前就已经出现了。 这块琥珀中除了这只蜜蜂 ,还包裹了 4 朵花。科学家认为 ,这只蜜蜂当时正在这些花周围飞来飞去。它们具 有现在蜜蜂的几种特征和形态结构包括分叉的毛 ,研究人员认为这种毛与采集花粉有关。当然 ,蜜蜂是重要的传 粉媒介 ,这个化石意味着蜜蜂在白垩纪早期到中期开花植物快速多样化上可能起了作用。波伊纳尔表示 ,这将有 助于科学家理解在当时环境下开花植物在数量和种类方面快速增长的原因。 论文合著者、康奈尔大学蜜蜂研究专家布赖恩·丹福思的分析表明 ,这只蜜蜂为雄蜂 ,头部呈心形 ,有些特征与 现代肉食性的黄蜂类似 ,比如后足短小。 丹福思认为 ,这只蜜蜂并非现代蜜蜂的直系祖先 ,它很可能属于蜜蜂进化树中十分靠前的一类 ,早已灭绝。 琥珀是一种由古代植物的树脂经过长时间地质作用而形成的化石 ,其中可能会包裹一些植物的叶子、花粉以 及昆虫等。本期封面照片引自 http :ΠΠnews. nationalgeographic. comΠnewsΠ2006Π10Π0610252oldest2bee. html。 (本刊) ·488·　 昆虫知识 　Chinese Bulletin of Entomology 2006 43 (6)