秦艽总苷对人肝癌细胞SMMC-7721体外作用的研究【摘要】 目的观察秦艽总苷对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。
方法
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MTT法检测秦艽总苷对人肝癌SMMC-7721细胞生长的影响，流式细胞仪
分析
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细胞凋亡率，瑞-姬氏染色观察细胞形态变化。结果秦艽总苷浓度为125，250，500，1000μg/ml时，SMMC-7721细胞的生长受到不同程度的抑制，且有时间和浓度依赖性;流式细胞术检测显示一定浓度的秦艽总苷可诱导SMMC-7721细胞凋亡；倒置显微镜下SMMC-7721细胞出现细胞凋亡的形态学改变。结论一定浓度的秦艽总苷对人肝癌细胞SMMC-7721有抑制增殖和诱导凋亡的作用。【关键词】 秦艽总苷；SMMC-7721细胞；凋亡 中药秦艽味苦、辛，性平,具有清热、除湿、止痛的功效。关于秦艽药理学方面的研究证明,秦艽具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热、镇痛、免疫调节、保肝利胆等作用［1～9］。本研究以人肝癌细胞SMMC-7721为研究对象，观察秦艽总苷对SMMC-7721细胞的生长、细胞凋亡以及形态方面的影响，并以龙胆苦苷（>99%）作对照，比较相同浓度下对细胞作用的强弱。现报道如下。 1
材料
关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料
与仪器 1.1 样品 秦艽总苷(艽龙胶囊)购自西安正大制药有限公司，龙胆苦苷标准品（>99%）购自上海华美工程公司。秦艽总苷用PBS溶解，20μl过滤除菌，获1g/ml储备液备用；龙胆苦苷用PBS溶解，20μl过滤除菌，获104μmol/L备用。 1.2 细胞系 SMMC-7721细胞由南京中医药大学药理实验室提供。 1.3 试剂 胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司，DMEM培养液购自Gibco公司，AnnexinV-FITC凋亡试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司，瑞-姬氏染液购自南京建成生物工程研究所。 1.4 仪器 细胞培养箱（HT151）购自上海力申科技有限公司，酶联免疫检测仪（SUNRISE）购自瑞士TECAN公司，BDFACSCalibur流式细胞仪购自北京希尔诚兴业科技有限
责任
安全质量包保责任状安全管理目标责任状8安全事故责任追究制幼儿园安全责任状占有损害赔偿请求权
公司。 2 方法 2.1 SMMC-7721细胞培养 SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。待细胞达80%～90%融合状态时用0.25%胰蛋白酶消化后传代。实验期间不断冻存细胞，实验时取指数生长期细胞。 2.2 细胞生长情况测定 细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用DMEM培养液调细胞浓度为104个/L，每孔90μl接种于96孔培养板内，分别加入10μl31.25，62.5，125，250，500，1000μg/ml的秦艽总苷，设6个复孔。并设立加104μmol/L的龙胆苦苷对照组，加PBS的阴性对照组。培养24，48，72h后加入5mg/ml的MTT20μl继续培养4h，吸弃孔内培养液后每孔加入DMSO100μl,使结晶充分溶解，酶标仪测其吸光度，波长550nm。细胞生长抑制率（%）=（1-药物组吸光度/阴性对照组吸光度）×100%。 2.3 流式细胞仪测定 SMMC-7721细胞凋亡情况用上述方法将细胞浓度调为105/L，每孔2700μl接种于6孔培养板内，分别加入300μl的1，5，10mg/ml的秦艽总苷，设立3个复孔，并设立加104μmol/L的龙胆苦苷为阳性对照组，加PBS为阴性对照组。继续培养48h后，吸弃孔内培养液，收集细胞，离心，用PBS洗2次，加入500μl的BindingBuffer悬浮细胞，加入5μlAnnexinV-FITC混匀后，加入5μlPropidiumIodide,混匀,室温、避光、反应15min后在上机检测细胞凋亡。 2.4 瑞-姬氏染色观察 细胞形态将盖玻片置于六孔板内，分别2700μl106个/L的细胞悬液，加入1000μg/ml的秦艽总苷300μl,并设立阴性对照组，继续培养48h，吸弃孔内培养液，取出盖玻片平置于染色架上，滴加复合染液3～4滴，使其迅速盖满盖玻片，染色1min后滴加缓冲液6～10滴，轻摇玻片，使其充分混合，5～7min后自来水冲去染液，待干后于光学显微镜检查。
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