外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测-jgh

实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测一．实验目的1．通过本实验掌握外源基因在原核细胞中表达的特点和方法；2．掌握SDS-PAGE的制备及其分离原理。二．实验原理本实验介绍一种常用的表达载体――pET载体系统。在pET系列载体中，外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚合酶的调控，这类载体是Studier等于1990年首先构建的，后来得到很大发展。它们的典型特点是带有pBR322的大肠菌素E1(colEl)复制区。从而赋予宿主菌氨节青霉素或卡那霉素抗性。在这些载体中，编码序列在多克隆位点插入，置于天然T7RNA聚合酶启动子(φ10启动子)或所谓的T7lac启动子的控制之下，后者是带有lac操纵子(larO)序列的天然T7RNA聚合酶启动子的衍生体。lac阻抑物的结合能阻断转录起始。将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30a表达载体（如图1）中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖)，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达，表达蛋白可经SDS-PAGE检测。SDS-PAGE分离蛋白原理组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的pH值和离子强度。聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状结构中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电荷的多少和蛋白质的大小和形状。根据迁移速率的不同，可将不同的蛋白质进行分离。SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。蛋白表达系统大肠杆菌表达系统是目前研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力：许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工（如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等）过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。酵母表达系统酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有对表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等真核生物的功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。酿酒酵母在分子遗传学方面被人们认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年利用酿酒酵母成功表达了第一个外源基因---干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophicyeast）为代表的第二代酵母表达系统。安速商务服务http://www.ansuedu.com/枭痋爿甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。三．实验材料表达质粒：pET-30a-GFP四．实验步骤1．目的蛋白的表达（1）含外源基因的表达菌株在LB培养基（含50μg/mlKana）中预培养过夜（2）按1/50的比例稀释菌液，于250r/min，培养3小时,使其OD600值达到0.6（3）加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L（4）继续培养12小时（5）取1.5ml菌液于10000r/min，离心2min，收获菌体2．目的蛋白的检测（1）凝胶制备分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约30~40min后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。（2）凝胶电泳取80ml电极缓冲液稀释5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80V恒压20分钟，120V恒压2小时（3）染色、脱色电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色0.5~1小时；之后，在脱色液中脱色1小时，观察目的蛋白表达情况。凝聚组份10％分离胶（5ml）5％浓缩胶（2ml）水30%丙烯酰胺混合液1mol/LTris(pH6.8)1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED1.91.71.30.050.050.0021.40.330.250.020.020.002五．注意事项1．含外源基因的表达菌株应预培养之后再转接至培养瓶中，最好不要将菌种直接接于培养瓶培养，诱导表达。2．表达菌生长至OD600值0.6左右为诱导适合条件，避免菌生长过浓。3．配制SDS胶时应注意充分混匀后加入玻璃板中，并待其充分凝固后使用。