生物化学课件

第三节蛋白质的分子结构蛋白质是由一条(单体蛋白质)或多条(寡聚蛋白质)具有确定的氨基酸序列的多肽链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大(NAA=M/110,128-18)单纯蛋白质（simpleprotein)：仅由氨基酸组成，不含其它化学成分。缀合蛋白质(conjugatedprotein)：除含有氨基酸外的各种化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为辅基(prostheticgroup)或配体(ligand)。单纯蛋白质（按溶解度分类）清蛋白球蛋白谷蛋白谷醇溶蛋白组蛋白鱼精蛋白硬蛋白缀合蛋白质（按非氨基酸成分分类）糖蛋白脂蛋白核蛋白磷蛋白金属蛋白血红素蛋白黄素蛋白单纯蛋白质分类结合蛋白质分类蛋白质（按生物学功能分类）酶调节蛋白转运蛋白贮存蛋白收缩和游动蛋白结构蛋白支架蛋白保护和开发蛋白异常蛋白蛋白质的形状和大小形状纤维状球状膜蛋白蛋白质的相对分子量从大约6000～1×106或更大一些。单体蛋白质(monomericprotein)：仅由一条多肽链组成。其相对分子量除以110估计氨基酸残基的数目。寡聚蛋白质(oligomericprotein)：由两条或多条多肽链组成。每条多肽链称为亚基(subunit)。蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次一级结构(primarystructure)：多肽链的氨基酸序列。二级结构(secondarystructure)：多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。三级结构(tertiarystructure)：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构。四级结构(quarternarystructure)：具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。蛋白质的构象和结构组织层次：蛋白质的构象：指蛋白质在天然状态下所特有的空间结构；结构组织层次：一级（共价键）、二级（氢键）、三级（多种非共价键）和四级（亚基缔合）　　四、蛋白质功能的多样性蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种特异性的结构基础。蛋白质的生物学功能：1.催化；2.调节；3.转运；4.贮存；5.运动；6.结构成分；7.支架作用；8.防御与进攻；9.异常功能；……蛋白质（protein）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：一.基本问题---肽一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。（公认的pro组织方式，证据？）由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽（寡肽？）。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。由于羰基碳-氧双键的靠拢，允许存在共振结构（resonancestructure），碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由CO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化，肽键中的4个原子和它相邻的两个α-碳原子多处于同一个平面上。多肽链可以看成由Cα串联起来的无数个酰胺平面组成3.肽的物理和化学性质：①游离α-NH2：pH活性低，化学性质相似(与AA中比较)②游离α-COOH：pH活性低，化学性质相似(与AA中比较)③侧链R基：pH活性和化学性质与AA中相似短肽的晶体是离子品格，在水溶液中以偶极离子存在。在pH0-14范围内，肽键中的亚氨基不能解离。小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。肽的化学反应也和氨基酸一样，游离的α－氨基、α－羧基和R基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反反应。双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度的总和，但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相加。净电荷的计算(P166-167)4.天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽(GSH)；蛇毒多肽等。二.蛋白质的一级结构1.蛋白质的一级结构(Primarystructure)包括：(1)组成蛋白质的多肽链数目.(2)多肽链的氨基酸顺序，(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。2.蛋白质的一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上万种不同蛋白质的一级结构被测定。(1)测定蛋白质的一级结构的要求A.样品必需纯（>97%以上）；B.知道蛋白质的分子量；(2)测定步骤①测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。②多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).③二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。★巯基的保护④测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；⑤分析多肽链的N-末端和C-末端★末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：A、二硝基氟苯（DNFB）法：N-末端游离氨基①酸水解后，N-末端AA成为黄色DNP-AA衍生物②排除侧链DNP衍生物的干扰：用有机溶剂抽提，侧链DNP衍生物留在水相B、丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9M。N-末端游离氨基的反应，生成PTH-AA衍生物可用有机溶剂抽提、干燥后做鉴定。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。C、异硫氰酸苯酯（PITC）法苯氨基硫甲酰肽噻唑啉酮苯胺苯乙内酰硫脲AAD、肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。(n-1)E、氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。F、羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。⑥多肽链断裂成多个肽段:可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解的方法有：A.酶裂解法胰蛋白酶(trypsin)这是最常用的蛋白水解酶，专一性强，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。得到的是以Arg或Lys为C-末端残基的肽段，肽段数目等于多肽链中Arg和Lys总数加1。肽链水解位点胃蛋白酶(pepsin)它要求被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸，如Phe-Phe。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的最适pH，前者是pH2，后者是pH8-9，由于二硫键在酸性条件下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro水解受抑。肽链水解位点嗜热菌蛋白酶（thermolysin）:常用于断裂较短的多肽链。R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Val,Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。葡萄球菌蛋白酶（Staphylococcalprotease)当裂解在磷酸缓冲液(pH7.8)中进行的，它能在Glu残基和Asp残基的羧基侧断裂肽键。如果改用碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)或醋酸铵缓冲液(pH4.0)时，则只能断裂Glu残基的羧基侧肽键。梭菌蛋白酶（clostripain）专门裂解Arg残基的羧基所形成的肽键。即使在6mol/L尿素中20小时内仍具活力，这样对不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。消化道内几种蛋白酶的专一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）B、　化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。溴化氰基锍甲基硫氰酸溴化亚氨内酯H2O肽酰⑦测定每个肽段的氨基酸顺序：Edman降解法(PITC)、酶解法、依核苷酸序列的推定法A、目标蛋白(抗原)抗体多核糖体mRNAcDNAaa序列B、Edman降解法由Edman于1950年首先提出，用于N末端分析为α-NH2的与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。苯氨基硫甲酰肽噻唑啉酮苯胺少一个AA残基的肽苯乙内酰硫脲AA示例(十肽的水解)A法水解得到四个小肽：A1Ala-PheA2Gly-Lys-Asn-TyrA3Arg-TyrA4His-ValB法水解得到四个小肽：B1Ala-Phe-Gly-LysB2Asn-Tyr-ArgB3Tyr-His-Val重叠法：Ala-Phe-Gly-Lys－Asn-Tyr-Arg－Tyr-His-Val⑧确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。⑨确定原多肽链中二硫键的位置：一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离（过甲酸处理）。+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay对角线电泳图解pH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段三.蛋白质的空间结构1.蛋白质的二级结构蛋白质的二级(SecondaryStructure)结构是指肽链主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有-螺旋、-折叠、-转角。-螺旋是链内形成氢键，其肽平面的键长和键角一定，肽键的原子排列呈反式构型，相邻的肽平面构成二面角。①多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；每个氨基酸残基绕轴旋转1000，沿轴上升0.15nm；②肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个酰胺基团的-CO基与第四个酰胺基团的-NH基形成氢键，即形成含有13个原子的环；③蛋白质分子几乎都为右手-螺旋(原因：R基与主链C=O中的O的空间位阻小)；④具有协同性效应。左手和右手螺旋(1)-螺旋(3.613-螺旋)I.-螺旋影响因素：A、R基的电荷性质；B、R基的大小；C、亚AA导致“结节”的产生。II.其它类型的螺旋：310-螺旋等　　-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。①在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角(线)上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与折叠片垂直。②-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。③-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。（2）-折叠蛋白质的β-折迭反平行β折叠平行β折叠从能量上看，反平β折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH---O几乎在一条直线上，此时氢键最强。在纤维状蛋白质中β折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。在纤维状蛋白质的β折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，β折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。（三）β-转角（β-turn）β-转角也称β-回折（reverse turn）、β-弯曲（β-bend）、发夹结构（hair-pin structure）β-转角是球状蛋白质分子中出现的180°回折，有人称之为发夹结构，由第一个aa残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。目前发现的β转角多数在球状蛋白质分子表面，β转角在球状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的1/4。β转角的特征：①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。②主链骨架以180°返回折叠。③第一个aa残基的C=O与第四个aa残基的N-H生成氢键。④C1α与C4α之间距离小于0.7nm⑤多数由亲水氨基酸残基组成。Gly缺少侧链，在β转角中能很好地调整其他氨基酸残基的空间阻碍；Pro具有环状结构，在一定程度上迫使β转角的形成。即：在-转角部分，由四个氨基酸残基组成(4个α-碳，共3个酰胺平面)，四个形成转角的残基中，第三个一般均为甘氨酸残基(或Pro)。弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。主要在球状蛋白的表面，约占全部残基的1/4。-凸起是-折叠股中额外插入了一个AA残基（４）无规卷曲　　没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象．不同的蛋白质，无规卷曲的数量和形式各不相同．　球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。２．超二级结构和结构域（１）超二级结构　　在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构：αα(在纤维状蛋白和球状蛋白中异同；七残基重复序列P220)；ββ；βαβ(大多为右手交叉)；βββ．　　★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域．ααβββαβ一些已知功能的超二级结构:（２）结构域　　　对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体形成的三级结构的局部折叠区就称结构域。　结构域通常是几个超二级结构的组合，是球状蛋白质的独立折叠单位；对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域，如肌红蛋白；较大的蛋白由两个或两个以上的结构域组成。结构域一般由100~200个氨基酸残基组成，但大小范围可达40~400个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的．结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上．结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动(别构效应)，使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性．★结构域与功能域的关系：有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是；功能域包含一个但通常是多个结构域３．蛋白质的三级结构与球状蛋白质　　蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构。包括主链和侧链的所有原子的空间排布。一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面。球状蛋白质的结构特征：①含有多种二级结构；②具有明显的折叠层次；③为紧密的球状或椭球状实体(有一定的空隙，且较集中于活性部位)；④疏水R基在分子内部（即疏水作用，为主要折叠动力），亲水R基在分子外部；⑤表面具有一个结合配体的空穴。注：一级结构决定高级结构（RNA酶复性实验P235）A、核糖核酸酶变性与复性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis变性复性RibonucleaseA:AminoAcidSequenceRibonucleaseAB、二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用RNA酶肽链上的一维信息控制肽链自身折叠成特定的天然构象，并由此确定了Cys残基两两相互接近的正确位置。二硫桥对肽链的正确折叠并不是必要的，但对稳定折叠结构作出贡献。蛋白质的三维结构归根到底是由一级序列决定的，三维结构是多肽链上的各个单键旋转自由度受到各种限制的 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 果。这些限制包括：肽链的硬度、肽链中疏水基和亲水基的数目和位置、带正电荷和负电荷的R基的数目和位置以及溶剂和其他溶质等。４．蛋白质的四级结构（1）有关四级结构的一些概念四级结构(quarternarystructure)指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式缔合而成的蛋白质结构。亚基一般是一条多肽链，有时也称单体。本身具有球状三级结构。原（聚）体蛋白质单体蛋白质寡聚蛋白质同多聚杂多聚（2）四级结构的内容蛋白质的四级结构涉及亚基种类和数目以及各亚基或原聚体在整个分子中的空间排布，包括亚基间的接触位点（结构互补）和作用力（主要是非共价相互作用）。对称性是四级结构的重要性质(指亚基缔合)。（3）在结构与功能上的优势：①增强结构的稳定性：表面积/体积变小；②提高遗传经济性和效率；③使催化基团汇集在一起；④具有协同效应和别构效应。别构效应指结合在多亚基蛋白质分子的特定部位(受体)上的配体对该分子的其他部位所产生的影响。分为同促效应和异促效应如，血红蛋白的四级结构的测定由佩鲁茨1958年完成，其结构要点为：球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基两条α链，两条β链，α2β2α链：141个残基；β链：146个残基分子量65000含四个血红素辅基亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部四．蛋白质分子中的共价键与次级键　　　一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水作用力(熵增加)、氢键、范德华力（三种情况）、盐键维系蛋白质分子的四级结构：疏水键、离子键、氢键、范得华力。（亚基缔合的驱动力主要是疏水相互作用，亚基缔合的专一性则由相互作用的表面上的极性基团之间的氢键和离子键提供）a.盐键（离子键）b.氢键c.疏水作用力d.范德华力e.二硫键氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键氢键范德华力疏水相互作用力