水中大肠杆菌的检测方法(1)

水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法NIEAE201.54B一、  方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35±1℃、48±3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliformgroup）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100mL水中最大可能数（MPN/100mL）」表示100mL水中存在之大肠杆菌群数目。二、  适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。三、  干扰(一)  水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。(二)  检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。四、  设备(一)  量筒：100至1000mL之量筒。(二)  吸管：有0.1刻度之10mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。(三)  试管：大小约150×15mm之试管或有盖螺旋试管。(四)  发酵管（fermentationtube）：大小约22×9mm之玻璃管。(五)  稀释瓶：容量约100mL可灭菌之硼硅玻璃制品。(六)  锥形瓶：200至2000mL之可灭菌硼硅玻璃制品。(七)  采样容器：容量120mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。(八)  冰箱：温度能保持在4±2℃者。(九)  天平：待测物重量大于2g时，须能精秤至0.01g；待测物重量不大于2g时，须能精秤至0.001g。(十)  培养箱：温度能保持在35±1℃者。(十一)  高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15lb/in2或1.1Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。(十二)  高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。(十三)  接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。(十四)  pH计：精确度达0.1pH单位。五、  试剂(一)  试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25℃时小于2μmho/cm（μS/cm）。(二)  培养基，应使用市售商品化培养基。１、  硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Laurylsulfatetryptosebroth，简称LST）1倍浓度LST培养基含有下列成份：胰化蛋白胨（Tryptose）      　20.0g乳糖（Lactose）        　5.0g氯化钠（NaCl）  　        5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）  　      2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）  　      2.75g硫酸月桂酸钠（Sodiumlaurylsulfate）    0.1g试剂水           1L配成2倍浓度（取71.2gLST培养基粉末溶于1L试剂水），完全溶解后，分取10mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在6.8±0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4±2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。２、  煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliantgreenlactosebilebroth，简称BGLB）1公升的BGLB培养基中含有下列成份：蛋白胨（Peptone）        10.0g乳糖（Lactose）        　10.0g牛胆粉（OxgallPowder）       20.0g煌绿色试剂（BrilliantGreen）  　     0.0133g试剂水  　          　1L取40gBGLB培养基粉末溶于1L试剂水，完全溶解后，分取5至10mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，其pH值应在7.2±0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4±2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。(三)  无菌稀释液１、  磷酸二氢钾储备溶液取3.4g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于50mL的试剂水中，俟完全溶解后，以1.0NNaOH溶液调节其pH值为7.2±0.1，然后加试剂水至100mL，灭菌（过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟）后储存于冰箱中备用。4±2℃下保存期限为3个月。２、  氯化镁储备溶液取8.1g氯化镁（MgCl2‧6H2O），先溶于少量试剂水，俟完全溶解后，再加试剂水至全量为100mL，灭菌（过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟）后，储存于冰箱中备用。4±2℃下保存期限为3个月。３、  无菌稀释液分别取10mL氯化镁储备溶液和2.5mL磷酸二氢钾储备溶液再加入试剂水至2,000mL，混摇均匀后，分装于稀释瓶中，经121℃灭菌15分钟，作为无菌稀释液备用。如欲用于水样稀释，分装之无菌稀释液灭菌后体积须为90±2.0mL。4±2℃下保存期限为3个月。六、  采样与保存(一)  盛装水样检验微生物之容器，应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋，且于采样时应避免受到污染。水样若含有余氯时，无菌容器中应加入适量之无菌硫代硫酸钠（采取加氯之废水时，每100mL水样中加入0.1mL、10%硫代硫酸钠可还原15mg/L余氯。采取含氯之饮用水水样时，每100mL之水样如加入0.1mL之3%硫代硫酸钠，可中和之余氯量约为5mg/L。）。(二)  采样前应清洁手部，再行采水样，所采水样应具有代表性。(三)  运送时水样温度应维持在小于10℃且不得冻结，而实验室内保存温度应维持在4±2℃。(四)  水样应于采样后24小时内完成推定实验之水样添加步骤（七、步骤(一)４、），并置入培养箱中培养。(五)  水样量须以能做完所需检验为度，但不得少于120mL。七、  步骤试验分两阶段进行。首先进行推定试验，若推定试验结果为阳性反应，则继续进行第二阶段之确定试验，如结果仍是阳性反应则显示有大肠杆菌群存在。各试验步骤如下述：(一)  推定试验１、  慎选发酵管中没有气泡且未污染之10mL、2倍浓度LST试管。２、  水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇晃25次以上，以使样品充分混摇均匀。３、  视水样中微生物可能浓度范围进行水样稀释步骤，使用无菌吸管吸取10mL水样至90mL无菌稀释液中，形成10倍稀释度水样，混合均匀，而后自10倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列适当之100、1000、10000倍等稀释水样，进行稀释步骤时，均需更换无菌稀释吸管，水样稀释步骤如图一所示（注1）。４、  以无菌吸管分别取各稀释度10mL水样至内含10mL2倍浓度的LST试管中，每一稀释度各作5支，小心混合均匀，混合后发酵管内不可产生气泡。５、  在35±1℃培养箱中培养48±3小时，观察并记录发酵情形，若有气体产生则推定试验为阳性反应，若无气体产生则推定试验为阴性反应，但若培养液呈混浊状态，虽无产气，亦应进行确定试验。(二)  确定试验若推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时，则使用BGLB进行确定试验：１、  慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管。２、  利用无菌接种环自产生气体以及混浊之LST培养基试管中，接种一圈培养液至BGLB培养基试管中。３、  在35±1℃培养箱中培养48±3小时。４、  在48±3小时内，BGLB培养基试管如有气体产生，则确定试验为阳性反应。八、结果处理(一)  经确定试验确认BGLB试管为阳性反应后，应以「100mL水中最大可能数（MPN/100mL）」计算及记录。5支发酵管连续三种稀释度之MPN可查表一。(二)  表一所示接种之水样量为10mL、1.0mL及0.1mL，若所用之稀释度有三种以上时，采用最具意义之三种稀释度，查表后再计算100mL水中大肠杆菌群最大可能数。稀释度之选取方式如下：１、  先选取5管均呈阳性反应的最高稀释度（此时稀释度较低之各组试管必须全部呈阳性反应），再选取下两个稀释度（如表二水样别a）。２、  如果稀释度最低的一组并非5管均呈阳性反应，则选取稀释度最低的一组，再选取下两个稀释度（如表二水样别b、c）。３、  如果依据上述原则（１、及２、）选取3个稀释度后，下一稀释度试管组仍有阳性反应试管，则舍弃原先3组中稀释度最低的一组，纳入下一稀释度的数据（如表二水样别d）。４、  如果依据上述原则（１、至３、）选取3个稀释度后，更高稀释度之试管组仍有阳性反应试管，则把更高稀释度之阳性反应试管数加至原先3组中稀释度最高的一组（如表二水样别e）。(三)  100mL水中大肠杆菌群最大可能数（MPN/100mL）之计算公式如下：结果小于100时，以整数表示（小数字数四舍五入），菌落数大于100以上时，只取两位有效数字：例如110以1.1×102表示，16,000以1.6×104表示。(四)  检测纪录须注明采样时间、培养起始及终了时间、培养基名称、培养温度及各稀释度的数据等相关数据。九、  质量管理(一)  微生物采样人员及检测人员应具备微生物基本训练及知识。(二)  每批次采样时应进行运送空白。(三)  每批次或每10个水样需进行试剂空白实验。(四)  新购入之培养基，每批号均须以大肠杆菌群阳性控制菌株（如E.coli、Enterobacteraerogenes、Citrobacterfreundii）进行测试，以确保数据质量。(五)  若一季期间水样均未检出大肠杆菌群，则须以大肠杆菌群菌株进行培养基测试，以确保数据质量。(六)  本方法培养所得之细菌可能具有感染性，检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理。十、  精密度及准确度略十一、  参考数据(一)  APHA.2005.StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater,21stEdition,Section9221.AmericanPublicHealthAssociation,Washington,D.C.(二)  Difco&BBLManual:ManualofMicrobiologicalCultureMedia.2003.BDDiagnosticSystems.注1：  水样如须稀释，建议于稀释后30分钟内完成检测步骤，以免造成细菌死亡或增生，影响实验结果。图一　水样稀释步骤表一三连续稀释度（10mL、1mL、0.1mL）五试管重复测试时，阳性结果组合之MPN指数及95%信赖区间阳性反应组合MPN/100mL95%信赖区间阳性反应组合MPN/100mL95%信赖区间下限上限下限上限0-0-0<1.8—6.84-0-3259.8700-0-11.80.0906.84-1-0176.0400-1-01.80.0906.94-1-1216.8420-1-13.60.70104-1-2269.8700-2-03.70.70104-1-33110700-2-15.51.8154-2-0226.8500-3-05.61.8154-2-1269.8701-0-02.00.10104-2-23210701-0-14.00.70104-2-338141001-0-26.01.8154-3-0279.9701-1-04.00.71124-3-13310701-1-16.11.8154-3-239141001-1-28.13.4224-4-034141001-2-06.11.8154-4-140141001-2-18.23.4224-4-247151201-3-08.33.4224-5-041141001-3-1103.5224-5-148151201-4-0103.5225-0-0236.8702-0-04.50.79155-0-13110702-0-16.81.8155-0-243141002-0-29.13.4225-0-358221502-1-06.81.8175-1-033101002-1-19.23.4225-1-146141202-1-2124.1265-1-263221502-2-09.33.4225-1-384342202-2-1124.1265-2-049151502-2-2145.9365-2-170221702-3-0124.1265-2-294342302-3-1145.9365-2-3120362502-4-0155.9365-2-4150584003-0-07.82.1225-3-079222203-0-1113.5235-3-1110342503-0-2135.6355-3-2140524003-1-0113.5265-3-3170704003-1-1145.6365-3-4210704003-1-2176.0365-4-0130364003-2-0145.7365-4-1170584003-2-1176.8405-4-2220704403-2-2206.8405-4-32801007103-3-0176.8405-4-43501007103-3-1216.8405-4-543015011003-3-2249.8705-5-0240707103-4-0216.8405-5-135010011003-4-1249.8705-5-254015017003-5-0259.8705-5-392022026004-0-0134.1355-5-4160040046004-0-1175.9365-5-5>1600700—4-0-2216.840表二判读说明水样别水样体积（mL）阳性反应组合结果（MPN/100mL）1010.10.010.001a5/55/52/50/50/55-2-04.9×102b4/55/51/50/50/54-5-148c0/51/50/50/50/50-1-02d5/54/54/51/50/54-4-14.0×102e5/54/54/50/51/54-4-14.0×102