真核细胞DNA提取

真核细胞DNA提取真核细胞DNA的提取一、实验目的：1、学习并掌握CTAB法提取植物总DNA的基本原理。2、了解CTAB法与ＳＤＳ法提取桉树叶总DNA的基本操作步骤。二、实验原理：　　　　核酸分子是基因工程研究的主要对象。核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。　　核酸包括脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA两种分子。在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。由于，脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白在电解质溶液中溶解度明显不同，据此可将二者分离。植物细胞经过充分冷冻，细胞核在研磨时容易破裂，利于提取ＤＮＡ．ＤＮＡ在低温...

真核细胞DNA的提取一、实验目的：1、学习并掌握CTAB法提取植物总DNA的基本原理。2、了解CTAB法与ＳＤＳ法提取桉树叶总DNA的基本操作步骤。二、实验原理：　　　　核酸分子是基因工程研究的主要对象。核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。　　核酸包括脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA两种分子。在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。由于，脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白在电解质溶液中溶解度明显不同，据此可将二者分离。植物细胞经过充分冷冻，细胞核在研磨时容易破裂，利于提取ＤＮＡ．ＤＮＡ在低温下易于凝集。　　植物总DNA的抽提常采用两种方法：SDS法和CTAB法。CTAB法：简便、快速，DNA产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1～0.5mMNaCl）下，CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70％～75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇（24:1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。SDS法：过程长，纯度高。阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）能破坏细胞膜，并能解聚脱氧核糖核蛋白复合物（DNP），使DNA从脱氧核糖核蛋白中释放出来。SDS使脱氧核糖核蛋白中的组蛋白分离变性形成沉淀，从而得到纯净的DNA。利用DNA不溶于乙醇等有机溶剂的特点将DNA沉淀下来。　　1.仪器各量程微量移液器；研钵；水浴锅；离心机；液氮贮存装置；制冰机；天平2.试剂及相关耗材各式微量移液器枪头；Dorf管；SDS提取缓冲液（100mMTris-HCl，pH8.0；50mMEDTA，pH8.0；0.5MNaCl；10mMβ-疏基乙醇，使用前加入）；20％SDS；5MKAc；CTAB提取缓冲液（2%CTAB，1.4MNaCl，20mMEDTA，100mMTris-HCl，pH8.0）；氯仿/异戊醇（24:1,v/v）；4MNaCl；无水乙醇；75%乙醇；TE缓冲液。三、实验材料一）CTAB法提取桉树叶片DNA1．植物组织的破碎：取0.2-0.4g新鲜的桉树叶片，在液氮中研磨至粉末状，转入1.5ml离心管中。2．细胞的破碎：迅速加入1ml预热（65°C）的提取缓冲液，65°C水浴中保温30min以上，每5min上下颠倒1次。3．核酸的分离：12000g离心5min，吸取上清液约600μl，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。四、操作步骤4．12000g离心5min，取450μl上清于一新1.5ml离心管，加入1ml95%乙醇和45μl10MNH4Ac，混匀，室温放置10min。5．12000g离心10min，去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥约30min。6．核酸的溶解：加入50μlTE或无菌水（含20μg/mlRNase），置于4℃过夜，待DNA溶解后，检测DNA浓度及质量。７．核酸的纯化：加入等体积的异丙醇室温下沉淀DNA；用70%的乙醇清洗沉淀；沉淀经室温干燥后溶于500mlTE缓冲液中。二）SDS法提取桉树叶片DNA1．取0.2～0.4g新鲜的桉树幼嫩叶片，加入液氮研磨成粉。2．将冻粉转移至1.5ml离心管中，加入800μl提取缓冲液，轻轻晃动使粉末充分散开。3．加入100μl20％SDS，充分混匀，65℃水浴30min，其间轻轻摇晃2-3次。4．加入160μl5MKAc，充分混匀，冰浴放置30min。5．4℃下12000g离心15min，取上清至新管，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）抽提，轻轻颠倒数次，放置片刻。6．4℃下10000g离心10min，吸取上层水相到另一离心管中，加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，室温静置30min，观察沉淀生成。7．4℃下8000g离心10min，倾去上清液，用75%的乙醇洗涤沉淀，吹干。8．用100μlTE充分溶解，-20℃存放备用。DNA提取常见问题 1．核酸DNA分子对机械力十分敏感。因此操作过程中动作应尽量轻柔，转移用的枪头最好是剪过的，避免剧烈振动可获得较长的DNA分子。2．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的β-ME处理。3．所用试剂必需灭菌，带手套操作。4．取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。五、注意事项5．要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。6．所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。7．异丙醇、乙醇、NaAc、KAc等要预冷，以减少DNA的降解，促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。8．氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。

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