生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术

第十四章电泳分离技术前言1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。1.电泳技术的基本原理u:泳动度or泳动率(cm/伏·秒or分)V:泳动速度:cm/秒or分E:电场强度:伏特/cmd:泳动距离:cmt:电泳时间:秒/分U:电压:常压(100—500v)高压(500—10000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度)(1)泳动度u(迁移率):带电质点在单位强度电场下的泳动速度不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度(2)影响泳动率u的因素内因：1.净电荷2.质点大小3.质点形状外因：1.V(U/L)2.缓冲液的pH(pH恒定)3.离子强度[I]最适:0.02-0.24.电渗：液体对固体支持物的相对移动(3)电泳类型a.载体电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳b.自由界面电泳支持物为溶液，很少用。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素(C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。■凝胶的聚合反应：Ammoniumpersulfate(freeradicalinitiator)过硫酸铵Acrylamide(monomer)Bis(acrylamide)(bridge)TEMED(catalyst):四甲基乙二胺自由基的生成者凝胶的基本單位:丙烯酰胺交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺帮助传递自由基的加速剂Acrylamide有毒性！-(OS-SO)442-2SO4CH2=CH-CO-NH212112核黄素-TEMED系统与过硫酸铵-TEMED系统■丙烯酰胺单体聚合过程：聚合反应交联剂造成分枝端点自由基可再延续freeradicalBisBis聚合反应交錯连結自由基形成光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。化学聚合：制小孔胶。过硫酸铵(NH4)2S2O3APS(引发剂)N,N,N,N’-四甲基乙二胺，TEMED(加速剂)2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳原理三种物理效应⑴样品浓缩效应⑵分子筛效应⑶电荷效应三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高（1）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。①凝胶孔径不连续性②缓冲液离子成份的不连续性③pH的不连续性①凝胶孔径不连续性单体浓度交联度大孔胶:T=3%C=2.0%小孔胶:T=7%C=2.5%凝胶网孔大小:聚合链长度:由Acr浓度交联程度:由Acr与Bis相对比例Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比如:AcrBisT(%)小孔28.0g0.735g7%大孔10.0g2.5g2.5%凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质<10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-10>5×1052-5核酸(RNA)<10415–20104–1055-10105-2×1062-2.6②缓冲液离子成份的不连续性大孔胶pH=6.7先行离子：Cl-存在于凝胶层中任何pH值下随后离子：Gly-存在于电极缓冲液中pI=6.0pKα1=2.34pKα2=9.70在pH=6.7时，只有少数解离为Gly-，多数为Gly+-。Pr分子在pH6.7时以Pr-形式存在③pH的不连续性pH大孔(浓缩)胶6.7小孔(分离)胶8.9缓冲液8.3A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子、慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。电泳过程示意图不连续系统浓缩效应示意图连续胶与不连续胶:连续胶：胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份不变不连续胶:胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份变化连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板(前,后)样本梳间隔条间隔条浓缩胶分离胶不连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板(前,后)样本梳间隔条间隔条■电泳凝胶系统的组成：1电泳系統pH胶体浓度缓冲液上层(负极)缓冲液2样品溶液3浓缩胶6.94分离胶胶体5下层(正极)缓冲液Tris-HClTris-HClTris-glycineTris-glycineTris-glycine8.38.38.38.35%7.5~20%---●不连续胶有聚焦样品的作用变性胶与非变性胶：变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行，主要指SDS变性条件下进行。非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂。■SDS在蛋白质 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面均匀敷上一层负电：SDSboiling变性蛋白质成一线状分子原态蛋白质並且均匀带上一层负电荷非极性尾部极性头部■三种不同性质蛋白质的电泳比较：MolecularWeightpINativePAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternaryStructureXYZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastXYZ--+电泳装置图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3架膜加盖接导线，开机3.醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白电泳仪器实验操作：浸泡将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。点样用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。电泳将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。染色将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重染色10min。漂洗将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。4.等电聚焦(IsoelectrofocusingIEForEF)原理Pr为两性电解质，不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，因此pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的、稳定的、线性的pH)。原理（续）当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。如扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。方法（EF的关键）⑴载体两性电解质CA分辨率0.01pH⑵固相pH梯度以具弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物CH2＝CH─CO─NH─RR=─COOHR=─4级氨基R为弱酸or弱碱,形成缓冲体系体系分辨率达0.001pHpH梯度范围最窄可为0.01pH/cmCAIEF是两性分子,在凝胶聚合时形成两性分子；在电场中,CA迁移到自己的pI而形成pH梯度.5.电泳技术问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 及对策1).低离子溶液中,不同电荷的蛋白质分子间会发生相互静电作用,增加溶液离子强度可减少这种作用,但会提高电泳时的电流,使产热更多,温度升高又促进蛋白质的扩散,使区带变宽,分辨率下降.因此电泳缓冲液的离子强度必须控制适当。0.02-0.2M的离子强度离子强度低,速度快,发热低,有电渗离子强度高,速度慢,发热大电泳技术问题及对策2).蛋白质分子所带净电荷主要取决于电泳缓冲液的pH值,应仔细调整和控制电泳缓冲液的pH值,使各组分分子的净电荷数差异加大.但极端pH下蛋白质会变性失活,因此一般控制在pH4.5～9.5之间;电泳技术问题及对策3).缓冲液的种类,浓度和其他电解质浓度影响蛋白质所带电荷的极性和数量,同时还影响蛋白质分子间的相互作用,因此必须根据分离溶质的不同选择合适的缓冲系统;电泳技术问题及对策4).表面活性剂(SDS等)强烈破坏蛋白质分子间的非共价作用,使蛋白质分子为表面溶剂分子所包围,阻止了蛋白质之间的相互作用,同时也消除了不同蛋白质固有的电荷差异;电泳技术问题及对策5).控制电泳介质的有效黏度,包括选择适当的凝胶孔径和添加能增加介质黏度的物质;电泳技术问题及对策6).电泳过程发热量的控制:发热的难题：蛋白质变性;蛋白质区带扩散,分辨率下降;对策:减少发热:降低电流,提高电压;提高传热表面积;提高材质的传热系数;提高冷却系统的温差.减少扩散:增加缓冲系统或介质的黏度可以减少扩散;在微重力作用下进行电泳;思考什么是等电点电泳?什么是等电聚焦电泳?二者的主要差别在什么地方?