基因工程总复习

第一章基因工程：利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术2基因克隆：在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，转入宿主细胞使这得以永久保存和复制的过程称为基因克隆。（基因工程或重组DNA技术则侧重于验证上述过程所获得遗传物质新组合在宿主细胞内的表达与功能鉴定）3.重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。4.基因操作：对生物体的遗传物质进行人为的操作，使之发生修饰和改变的过程。简答说明基因工程的理论基石和技术基础理论基石（三大发现）：DNA是遗传信息的载体；DNA的双螺旋机构模型及其半保留复制机理；中心法则和遗传密码及其通用性。技术基础（三大发明）：DNA的体外切割和连接；载体和宿主的发现、改造和利用；DNA测序、电泳分离和分子杂交（Southern、Northern和WestBlot）简述基因工程研究的主要内容1）克隆载体的研发2）受体系统的研发3）目的基因研究4）工具酶5）新技术研究（基因枪、放射性同位素探针、PCR等）简述基因工程的主要应用领域1）基因工程药物（重组活性多肽或蛋白、疫苗和DNA疫苗等）2）转基因作物（抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆及生物反应器等）3）转基因动物（乳腺生物反应器）4）工业（纤维素酶、酿造业菌株、抗菌素生产菌株的工程改造，等）5）环保（生物降解塑料原料基因工程和生物防治农药污染基因工程等）用5个词描述基因工程的过程。（找、剪、连、转、选）第二章天然DNA的制备DNA变性：是指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程。DNA复性：变性的DNA的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称为DNA的复性。Tm值：将紫外吸收的增加量达最大量的一半时的温度值称为熔解温度（Tm）简述DNA与基因工程有关的主要特性。1）变性：在一定的条件下，DNA双链因链间氢键破坏而解链的过程。如温度变性，90℃足以使所有的DNA变性；其他,如pH、离子强度、脱水剂等。2）复性：变性DNA分子因链间氢键恢复而重新形成双链DNA的过程。若是温度变性，当缓慢降低温度时，该过程得以进行。以上是PCR反应的依据。3）带电性：一般pH下，带负电荷，可电泳分离。4）水溶解性：DNA属于生物大分子，且带电荷，通常分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是DNA提取和分离的依据。简要说明天然DNA的主要提取过程。1）生物材料的准备使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最高的组织。如细菌培养至对数生长期后期；植物材料用幼嫩植株，且暗培养1~2天或黄化苗；动物以肝脏为好，须将胆囊除尽。2）细胞的裂解裂解不够，DNA得率低；裂解过猛，DNA断裂。细菌可用溶菌酶、NaOH+SDS、煮沸、冰冻或超声波等方法处理。动植物组织，先粉碎材料，再裂解细胞。3）DNA的分离和抽提根据待提DNA的性质，将其与其他组分分离，进一步抽提DNA。一般先除去蛋白质，再沉淀DNA。提取质粒DNA时，先调节裂解液的pH值到12.6，使所有DNA沉淀，再调节pH值到中性，使质粒DNA复性从沉淀中释放出来。用RNase水解除去RNA制备大分子DNA应注意的两个原则：①防止和抑制内源Dnase对DNA的降解；②尽量减少溶液中DNA的机械剪切破坏。第三章分子克隆工具酶限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。同裂酶：识别序列相同而来源不同的酶。同尾酶：来源和识别序列各不相同，但产生出相同粘性末端的酶限制酶的Star活性：在特定条件下，某些酶在非识别序列处切割DNA的现象称为Star活性。限制性图谱：DNA分子上限制性核酸内切酶的识别序列分布图称限制性图谱（restrictionmap），或物理图谱平末端；两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中心所形式的断裂。粘性末端：两链的断裂位置交错、对称地绕着一个对称轴排列所形成的断裂。衔接头：一段已知序列且含有限制性核酸酶切酶识别序列和粘性末端的DNA片段连接子：一个较短的已知序列的且能都被限制性核酸酶切酶切割形成特定粘性末端的DNA片段，片段未被内切酶切割时是末端是平末端。连接酶：六大酶类之一，催化两个不同分子或同一分子的两个末端连接的酶。基因工程中常用的酶有哪些？各有何的用途？限制性核酸内切酶：识别DNA的特异性序列，并在特定位点上切割DNA,将两条链上的一个磷酸二酯键断开，在基因工程操作中，用同一内切酶切割载体和目的基因，以形成相同的末端，用于目的基因和载体连接。DNA连接酶：进行缺刻修复，连接两个DNA分子；一般利用DNA连接酶将载体和目的基因连接起来DNA聚合酶：催化DNA的合成，通常用于PCR反应，以后的大量的目的基因。何谓定向克隆？如何进行？即将待克隆的核酸分子按一定的方向连接入载体的分子克隆方法1，利用不同的限制性核算内切酶切割目的基因的两端，以形成不同的粘性末端2，在克隆载体的插入位置设置对应的两种不同的内切酶位点，经对应的内切酶切割后形成与目的基因互补的粘性末端3，DNA连接酶处理目的基因和克隆载体（克隆载体插入位置上设置两个不同的限制性内切酶位点，在外源DNA分子两端也放上相应的两个限制性酶切序列，经限制性酶消化后，所产生的DNA黏性末端分别互补结合，外源DNA就可定向插入载体。）说明限制性核酸内切酶产生Star活性的原因及其克服 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 。限制酶的Star活性：在特定条件下，某些酶在非识别序列处切割DNA的现象称为Star活性。Star活性因限制酶种类、DNA和反应条件的不同而不同，一般是由于一下原因：高浓度酶、高浓度甘油、低离子强度、Mn2+取代Mg2+或高pH。克服措施：①减少酶的用量，以避免过分酶切②减少甘油浓度③保证反应体系中无有机溶剂或乙醇④提高离子强度到100~150mmol/L⑤降低反应PH至PH7.0⑥保证使用Mg2+作为二价阳离子等第4、5章分子克隆载体1.载体：能将所承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。2.表达载体：含有强启动子、外源基因可在启动子的控制下转录成mRNA，并最终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达的载体。3. 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 载体：一种易于用生化方法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 表达产物的基因作为报告基因，通常由p-Basic、p-Enhancer、p-Promoter、p-Control组成的载体。4.质粒载体：以质粒DNA分子为基础构建而成的载体，主要用于原核生物和植物的基因转移以及建立基因组文库和cDNA基因文库。5.质粒：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。6.ccc-DNA：超螺旋共价闭环DNA分子7.迁移作用：由共存的结合型质粒引发的非结合型质粒转移的现象称为迁移作用。8.接合质粒：含tra基因的质粒，分子较大，拷贝数较少，宿主广，不安全，使用时应特别注意（tra基因，指令产生菌毛（pilus），促使宿主与受体接合，导致遗传物质转移）9.非接合质粒：不含tra基因的质粒，分子小，拷贝数多，不会自行接合转移，比较安全。10.显性质粒（表达型质粒）:除了控制与本身复制和转移相关的基因外，还携带其他基因，使宿主呈现出新性状的质粒。11.隐蔽质粒：宿主细胞含有，但无异样性状表露的质粒12.Cosmid（粘粒载体）：由质粒和含有cos位点的λDNA片段组装成一类新的克隆载体13噬菌粒载体：由质粒和单链噬菌体的部分序列重组而成的载体，称为噬菌粒（Phagemid或Phasmid）。能以质粒的方式进行高拷贝复制（500），在辅助噬菌体存在下，又能以M13噬菌体方式进行复制和包装。14定位整合克隆载体：除了一般质粒克隆载体必须具备的元件外，还含一或两个与整合平台区域核苷酸同源的序列（长度最好在1kb以上）。通过同源重组，把外源DNA片段定位整合到整合平台。15.整合平台：指受体细胞基因组上给定的一个供外源DNA定位整合区域。可处于基因区，也可处于基因间隔区。16.YAC（酵母人工染色体）：是将酵母染色体DNA的端粒（TEL）、DNA复制起点（ARS）和着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（HISA4和TRP1）基因序列克隆到pBR322中，构建成YAC克隆载体。此克隆载体的sup4基因上，组装了供插入外源DNA片段的克隆位点EcoRI17.PAC（P1人工染色体）：利用P1噬菌体基因组元件所构建的大片段DNA克隆系统。18.BAC（细菌人工染色体）：利用细菌的F质粒及其调控基因为基础构建的用于在大肠杆菌中克隆大片段DNA(100～300kb)的细菌染色体克隆载体。19.诱导型表达载体：指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体。20.反义表达载体：是利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。21.组织特异性表达载体：是指有一些特殊的调控序列（如启动子）可以调控基因只在一定的组织中有效的表达的载体。22.松弛型质粒：在细菌染色体外能大量独立复制的质粒。每个细菌中可存在数百到数千个拷贝。23.严谨性质粒：复制受到严格控制，每个细胞中的数量只有1～2个，在一定的细胞周期内复制；染色体不复制时，也不复制的质粒。24.附加体：一类在细菌和某些真核细胞中存在的染色体外的遗传物质，能在细胞中独立存在并进行自我复制，也能整合到染色体，随同染色体的复制而进行复制。25.转化子：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，经这一过程而获得外源遗传物质的受体菌称为转化子。26.重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。27.基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。28.限制修饰系统：是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。29.质粒不亲和性：不同质粒因亲缘关系密切等原因而表现出不能寓于同一细胞中的特性30.多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。31.α－互补：是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β－半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。按来源可将基因克隆载体分为哪几类？并说明各自的主要特点。质粒（plasmid）噬菌体（phage）病毒（virus）柯斯质粒载体（cosmid）人工染色体（如YAC、BAC）按功能分类：克隆载体、报告载体和表达载体。作为克隆载体必须具备的主要条件是什么？（1）必须含有允许外源DNA片断组入的合适位点。并且这样的克隆位点应尽可能的多。（2）克隆载体应能携带外源基因进入受体细胞，或能在受体细胞中自我复制；或能整合到受体细胞DNA中同步复制。（3）克隆载体必须含有供选择用的标记基因。以有利于克隆子的筛选和鉴定。（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。作为表达载体必须具备的主要条件是什么？如何鉴定转化子、重组子和转基因生物？第六章PCR技术及其应用PCR：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。RT-PCR；即反转录多聚酶链式反应，是对特定的RNA分子进行扩增的技术，可分成两个部分：（1）将目的RNA反转录（RT）形成cDNA;（2）以此cDNA为模板进行聚合酶链式扩增（PCR）。定量PCR：在PCR体系中加入荧光基因，利用荧光信号的累积实现实时监测整个PCR进程，对起始模板定量分析的方法。反向PCR;反向PCR(inversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。巢式PCR：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。特殊PCR主要有那些?各自的原理是什么?RT-PCR:RNA在逆转录酶作用下可以逆转录形成CDNA,CDNA可以在DNA聚合酶的作用下进行复制扩增。实时定量PCR:反向PCR:荧光基因在PCR反应过程中能产生荧光信号，特殊设备可以识别荧光信号，实时定量PCR通过荧光信号的强弱来监控PCR反应过程。巢式PCR：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。试述PCR反应的原理与应用.原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。应用：PCR技术的主要应用于基因克隆，即利用PCR技术扩增目的基因；基因检测，如遗传病的检测；基因配型，如HLA系统基因分析；基因鉴定，如亲子鉴定第7、8章目的基因制备与筛选策略SSH（抑制性减法杂交）：是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术，其核心技术是抑制性PCRRDA（代表性差别分析技术）：是一种利用PCR具有指数形式扩增双链，线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体的复杂度和多次更换cDNA两端接头引物等方法，达到克隆基因的目的的技术。DDRT-PCR（mRNA差别显示或称差别显示反转录PCR）：是由Liang和Pardee(1992)建立的一种分离、鉴定差别表达基因的方法，具有与PCR技术相似的简单、快捷和高效等特点。ESTs：利用表达序列标签（EST）即基因序列中一段含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，能特异地标记或表征基因的序列，长100~500bp，来寻找新基因的策略即为表达序列标签法(ESTs)。酵母双杂交：是根据真核生物转录调控的特点创建的一种体内鉴定基因的方法，是一种研究蛋白质－蛋白质之间的相互作用的技术，特别是研究蛋白质亚基和另一亚基的相互作用。cDNA文库：由cDNA的一套随机片段构成，其中每个片断连在一个单独的载体分子上，储存在宿主（大肠杆菌、噬菌体等）中并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组文库：是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。基因文库：基因克隆的群体。包括互补DNA文库和基因组文库等。简述cDNA文库构建的原理与步骤原理：高等生物具有大约104-5种基因，但在一定发育阶段的单个细胞或个体中，仅15％左右的基因表达。可见由mRNA出发反转录而产生的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。（不明）步骤：①先提总RNA，再纯化mRNA。②合成第一链cDNA③将mRNA-DNA转变为双链DNA④将合成的双链cDNA重组到载体上，导入寄主增殖简述基因组文库构建的原理与步骤原理：通过克隆载体使某种生物基因组的全部遗传信息贮存于一个受体菌的群体，（不确定）步骤：①提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；②DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；③重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；④阳性重组菌落或噬菌斑的选择。分离目的基因的方法：1）直接分离：①限制酶酶切分离法（适于从简单基因组分离目的基因，如质粒和病毒）②物理化学法（DNA片段的碱基组成差异较大，其理化性质明显不同，如浮力密度和解链温度等）有：密度梯度离心法、单链酶解法及分子杂交法等。③双抗体免疫法（适用于已分离纯化且足以产生特定抗体的蛋白质）④反转录法2）构建基因组文库分离3）构建cDNA基因文库分离4）利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因5）基因的化学合成(自学)筛选目的基因的方法：1）根据功能筛选：①特异蛋白分离法（根据特异蛋白的氨基酸序列，按照遗传密码及其简并性人工合成特异简并探针，从文库中筛选相应的基因）。②功能互补法（利用克隆片段与寄主细胞染色体DNA在功能上的互补性直接分离目的基因）。2）根据序列筛选①已知基因序列或同源基因序列克隆法②表达序列标签法③基因表达系列分析法（用来分离不同发育阶段和生理状态下差别表达基因）3）差别杂交及减法杂交法①差别杂交法（无可供选择的探针，也无任何有关目的基因的序列信息时，可采用此法；该法特别适于分离特定组织或特定发育阶段特异表达基因以及诱导表达基因）②减法杂交技术（通过DNA复性动力学原理富集目的基因，并以此构建减数文库分离克隆目的基因；尤其适于某些低丰度mRNA的cDNA克隆）4）差别显示法①mRNA差别显示也称DDRT-PCR（一种分离、鉴定差别表达基因的方法；几乎可检所有表达基因；可同时比较多种细胞类型；可同时展现所有差异；可同时检测基因的上调和下调表达。）②代表性差别分析技术③抑制性减法杂交（SSH）5）功能结合法6）DNA插入诱变法（主要用于植物基因克隆分离）有①转座子标签法；②T-DNA标签法7）基因定位克隆法（是人类或植物基因的克隆中常用方法，主要根据目的基因在基因组上的位置特性而不是编码产物来克隆基因。）8）分子间相互作用克隆法第9章转基因及其表达转化：重组质粒通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。转化子：经转化获得外源遗传物质的细胞称为转化子。感受态细胞：感受态细胞指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。融合蛋白：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。转基因沉默（transgenesilencing）:指外源基因在转基因生物中不能正常表达的现象，启动子（promoter）是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。其长度因生物的种类而异，一般不超过200bp。启动子是基因表达调控的重要顺式元件，具有如下特征：序列特异性;方向性;位置特性;种属特异性。增强子（enhancer）:能够增强启动子转录活性的DNA序列。其结构类似于启动子，由1~多个元件组成，每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。增强子长50~1500bp终止子（terminator）:终止转录的序列。绝缘子（insulator）：是基因表达的调控元件，也是一种边界元件，能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用。SD序列：存在于原核生物起始密码子AUG上游7—12个核苷酸处的一种4—7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3’端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。外显子：基因组DNA中出现在成熟RNA分子上的序列。外显子被内含子隔开，转录后经过加工被连接在一起，生成成熟的RNA分子。信使核糖核酸(mRNA)所携带的信息参与指定蛋白质产物的氨基酸排列。内含子：真核生物细胞DNA中的间插序列。这些序列被转录在前体RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中。内含子和外显子的交替排列构成了割裂基因。在前体RNA中的内含子常被称作“间插序列”。反义RNA（antisenseRNA）是一类与特定DNA序列互补的小分子RNA。编码反义RNA的DNA称为反义子RNAinterference(RNAi)：由双链RNA启动，在多种酶参与下，经过一系列步骤（包括siRNA的形成和双链降解等）将同源RNA降解的现象。简述转基因的主要方法与原理1）转化①Ca2+诱导的转化(Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热击收缩，使胞膜出现空隙，便于外源DNA进入。)②电穿孔法转化(在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。)③三亲本杂交接合转化④原生质体转化⑤基因枪转化2）转导:通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染途径将外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。简述重组子的筛选与分子鉴定的主要方法和原理筛选：1）载体遗传标记检测①抗药性筛选法②营养缺陷型筛选(载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子)③显色筛选法(载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选)2）克隆DNA序列检测（可用于鉴定）①限制性酶切图谱法(对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。)②菌落噬菌斑原位杂交法(根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。)③DNA序列分析法(在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列)3）外源基因表达产物检测重组子的分子鉴定1）分子大小鉴定2）限制酶酶切3）利用PCR方法筛选确定重组子4）核酸分子杂交检测法（具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。该技术用于重组子鉴定时，杂交的双方是待测序列和已知核酸片段（称为探针）。）真核基因表达调控的特点：表现为在特定的时间和特定的细胞内或在特定外界条件下特定基因表达，从而实现有序的、不可逆转的分化发育过程。因此，特定基因的表达依赖于一套特定的转录因子与DNA调控元件之间的相互作用。大多数真核生物的增强子包含多个不同转录因子的结合位点。当信号传至细胞核时，触发特定激活物与特定增强子准确结合，形成蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用的网络，从而激活或促进转录。说明转基因沉默的机制与克服措施。转基因沉默（transgenesilencing）:指外源基因在转基因生物中不能正常表达的现象，其机制主要有：1）位置效应：指基因表达受其在基因组中的位置影响的现象克服措施：基因打靶（定位整合）。2）转录水平沉默：是在DNA水平上的基因调控，主要由启动子甲基化或外源基因的异染色质化引起。克服措施：筛选单拷贝插入重组子、选用限制修饰系统缺陷型受体细胞。3）转录后水平沉默：是在RNA水平上的基因调控，更普遍。特点是外源基因能够转录，但mRNA合成后就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，因而不能指导mRNA的翻译。克服措施：尽量避免（如利用编码序列的简并性等）。4）翻译后沉默：主要是受体细胞的蛋白酶降解外源蛋白。克服措施：融合表达、分泌表达、包涵体表达、选用蛋白酶缺陷型受体。作为基因工程宿主必须具备的主要条件：①便于重组DNA导人。②能使重组DNA稳定存在。③便于重组体的筛选。④遗传稳定，易于扩大培养或发酵生长。⑤安全，无致病性，不造成环境污染。⑥利于外源基因表达产物积累，或能促进其高效分泌表达。⑦遗传密码无明显偏倚性。⑧具有较好的翻译后加工机制。⑨应用价值高。第10章细菌基因工程融合表达:目的基因与编码具有特殊活性的多肽或蛋白质的基因融合，构建成一个融合蛋白基因，不改变两个基因阅读框的基因表达方式。融合蛋白:将外源基因与受体菌基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框而表达的蛋白。分泌表达:外源基因含有指导信号肽的表达的序列，使得表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞外膜进入培养基的基因表达方式包涵体:包涵体是在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。转导：借助病毒、噬菌体或其他方法将外源DNA导入细胞并整合到宿主基因组上的方法。转化：通过外源DNA片段传递遗传信息的过程。转染：利用物理，化学的方法使受体细胞从环境中吸收DNA的方法表面展示:将外源基因的表达产物定位在微生物表面的基因工程技术试述促进转基因在大肠杆菌中表达的策略。答：1、优化表达载体的设计2、提高稀有密码子tRNA的表达作用3、提高外源基因mRNA的稳定性4、提高外源基因表达产物的稳定性5、优化发酵过程简述原核生物基因工程常用的载体和受体细胞。答：原核生物基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，链霉菌，蓝藻等常用的载体：大肠杆菌表达载体PBR-322，PUC-18，PUC-19;Gst融合表达载体PGEX,枯草芽孢杆菌整合载体PDG1730.简述细菌基因工程的主要应用？答：1、在农业领域中生产基因工程农药，抗虫抗病重组微生物，微生物肥料等。2、在食品和工业中生产基因工程菌，以产生改良的益生菌，生产酶制剂等。3、重组DNA技术生产医用抗生素4、利用环境微生物基因工程菌处理环境中的废弃物简述外源基因在细菌中的主要表达形式及优缺点。答：①包涵体优点：主要存在于细胞质，少数在细胞周质中；易于分离纯化：包涵体水难溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可分离；对蛋白酶有较好的抗性。缺点：没有正确的空间构象，因而无生物活性。②融合蛋白优点：利用tag的特性对融合蛋白进行亲和层析等分离提纯，因而大大简化了重组蛋白的纯化过程；保护外源蛋白不受宿主内蛋白酶的降解缺点：进行基因工程操作比较复杂，成功融合的蛋白种类不多③分泌型蛋白优点：简化了发酵后处理的纯化工艺；减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的概率；有利于形成正确的构象，获得较好的生物学活性或免疫原性的蛋白质。缺点：要在外源蛋白的N端加入添加编码信号肽的DNA序列，基因操作相对复杂，同时不能确保高效的分泌。④整合型外源蛋白优点：外源基因整合在染色体特定部位，随着基因组基因稳定的转录和表达缺点：需整合的载体一般是不能在受体细胞内进行自主复制的质粒或温度敏感型质粒。第11章酵母基因工程YEp（酵母附加体质粒）YRp（酵母复制质粒）YCp（酵母着丝粒质粒）YIp(酵母整合质粒):是以细菌质粒为基础并携带有一个段酵母基因能整合到酵母染色体上营养缺陷型：对某些必需的营养物质(如氨基酸)或生长因子的合成能力出现缺陷的变异菌株或细胞。必须在基本培养基(如由葡萄糖和无机盐组成的培养基)中补加相应的营养成分才能正常生长。简要描述表面展示原理。酵母表面展示主要采用与酵母匹配有关的a－凝集素和α－凝集素作为骨架蛋白，与外源基因编码的蛋白质或多肽相融合，使外源基因编码的蛋白质或多肽表达在酵母细胞壁表面。具体见 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 本284页。酵母转基因的方法有哪些?酵母DNA转化原生质体法离子溶液法电穿孔法为什么说酵母是一个非常重要的基因工程宿主?1)全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便；2)具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；3)大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；4)能将外源基因表达产物分泌至培养基中；5)不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）；6)酵母菌是最简单的真核模式生物酵母基因工程的应用：1）利用毕赤酵母生产饲料用植酸酶2）利用淀粉酿酒酵母的基因工程3）酵母表达异源蛋白（详见P286）第12章植物基因工程全能性:指个体某个HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/60813.htm"\t"_blank"器官或HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/46944.htm"\t"_blank"组织已经HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/640770.htm"\t"_blank"分化的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/3687.htm"\t"_blank"细胞在适宜的条件下再生成完整个体的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/71511.htm"\t"_blank"遗传潜力。组成型表达启动子：在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。组织特异启动子：在这启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。花蕾浸泡转化法：将生长至开花阶段的植物倒置悬浮在由基因改造的农杆菌，表面活性剂等构成的混合液中短暂浸泡以实现外源DNA转化的方法。Ti质粒：根瘤农杆菌染色体外的环状双链DNA质粒，能诱导植物产生异常氨基酸和冠瘿碱或二者之一，并诱生冠瘿瘤。卸甲Ti质粒:Ti质粒上的T-DNA中的致瘤基因全部去掉，丧失对植物的质瘤性，仅保留其两侧边界和T-DNA准确转移所必需的25个碱基序列的质粒。双元载体系统：将带有外源目的基因的T-DNA和Vir区，安置在不同的质粒载体上进行操作。报告基因：是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否成功的导入受体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。植物转基因的方法主要有那些?答：原生质体介导法基因枪法根癌农杆菌介导法种质系统的基因转移（花粉管通道法）植物转基因的载体主要有那些?答：取代型Ti克隆载体，如onc-Ti质粒克隆载体，onc+Ti质粒克隆载体中间质粒克隆载体，如共整合克隆载体，双元克隆载体如何利用农杆菌进行植物遗传转化?答：①根据需要，对野生型Ti质粒进行对应的一元载体构建或而二元载体构建②将目的基因连接到改造好的Ti质粒③利用构建好的Ti质粒导入农杆菌，并利用农杆菌将目的基因导入需要改造的植物特定组织中，实现植物遗传转化转基因植物的主要成就有哪些?答：抗虫，抗病转基因植物，抗性转基因植物的诞生转基因植物生物反应器，生产药物等转基因植物的品质改良第13章动物基因工程胚胎干细胞：由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制培养而筛选出的细胞，具有发育全能性，理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞稳定表达：基因工程表达系统中工程菌株或细胞虽经过多次传代或条件变化，但表达水平仍然保持稳定的现象。瞬时表达：外源基因进入受体细胞后，未整合进受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物。脂质体转化：是通过把外源DNA包装在一个磷脂泡内部，该磷脂泡再与靶细胞的细胞膜融合，促使外源DNA的转入的一种转化方式。乳腺生物反应器：是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称动物细胞转基因的目的?主要载体有哪些？转基因方法有哪些？目的是改变动物的遗传组成，增加动物的遗传我样性，赋予转基因动物新的表型特征，使其能更好的服务于人类社会。主要载体有：质粒型表达载体pBC1、病毒载体（腺病毒或反转录病毒等）、定向打靶载体等转基因方法：（分物理、化学及生物法三类）物理：电击法、显微注射法、基因枪法、超声波法等化学：磷酸钙法、脂质体法、原生质体融合等生物：病毒感染法怎样获得转基因老鼠？（详见书第262页）如何获得转基因蛙?转基因羊乳腺生物反应器是如何获得的?分析讨论如何实现在高等动物中细胞中的高效稳定表达?一、名词基因工程：在基因水平改造生物的技术体系。指在体外对DNA进行剪切、加工，使不同亲本的DNA分子重新组合，并把它引入细胞中表达出具有新遗传特性的生物过程。DNA重组（DNArecombination）：是指HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/758.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"DNA分子内或分子间发生的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/1015022.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"遗传信息的重新共价组合过程。包括HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/688262.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"同源重组、特异位点重组和HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/649995.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/8563.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"基因工程中的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/3853038.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"关键步骤。DNA变性：在一定的条件下，DNA双链因链间氢键破坏而解链的过程。条件：如温度变性，90℃足以使所有的DNA变性；其他,如pH、离子强度、脱水剂等。DNA复性：变性DNA分子因链间氢键恢复而重新形成双链DNA的过程。若是温度变性，当缓慢降低温度时，该过程得以进行。Tm值：即DNA解链温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，在PCR操作中是个很重要的参数。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。Southern印迹杂交(Sorthernblot）：是分子杂交的一种，其基本原理是将待检测的DNA样品从琼脂糖凝胶转移到滤膜，并通过80℃或紫外线处理将其固定，再与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断样品中是否存在某一基因，以及该基因所在限制性酶切片段的长度。被广泛应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。Northern印迹杂交(Northernblot）：是一种将RNA从HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/1035220.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"琼脂糖凝胶中转印到HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/3853370.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"硝酸纤维素膜上的方法。DNA杂交由Southern于1975年创建，称为Southern印迹杂交。RNA印迹杂交就对应地被称为Northern印迹杂交。主要用于检测样品中是否存在于探针同源的mRNA分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达。Western印迹杂交（WesternBlot）：是分子杂交方法的一种，主要过程是将HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/6251695.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"蛋白质样品从SDS-PAGE凝胶转移到膜上，然后特异性抗体检测目的蛋白是否存并判断其相对分子质量的，从而可在翻译水平上判断某基因是否表达在。标记基因：标记基因是一种已知功能或已知序列的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/8563.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"基因，能够起着HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/552529.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"特异性标记的作用。通常用来检验重组DNA转化成功与否和检测目的基因在细胞中的定位。报告基因(reportergene)：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。转化（transformation）：外源DNA通过膜进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。受体细胞(receptorcell)：又称宿主细胞（hostcell），指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞，包括原核、简单真核和高等真核细胞。感受态细胞：感受态细胞指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。转染(transfection)：将重组λ噬菌体或病毒DNA分子直接导入受体细胞中的过程称为转染。转导(transduction)：通过噬菌体（病毒）颗粒感染途径将外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。转化子（transformant）：指把供体的DNA整合到自身的基因组中的细胞.重组子（recombinant)：指含有重组DNA分子的转化细胞。复制子(replicon):是DNA复制是从一个HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/207975.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"DNA复制起点开始，最终由这个起点起始的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/433620.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"复制叉完成的片段。转基因沉默（transgenesilencing）:指外源基因在转基因生物中不能正常表达的现象，其机制主要有：位置效应：指基因表达受其在基因组中的位置影响的现象。克服措施：基因打靶（定位整合）。转录水平沉默：是在DNA水平上的基因调控，主要由启动子甲基化或外源基因的异染色质化引起。克服措施：筛选单拷贝插入重组子、选用限制修饰系统缺陷型受体细胞。转录后水平沉默：是在RNA水平上的基因调控，更普遍。特点是外源基因能够转录，但mRNA合成后就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，因而不能指导mRNA的翻译。克服措施：尽量避免（如利用编码序列的简并性等）。译后沉默：主要是受体细胞的蛋白酶降解外源蛋白。克服措施：融合表达、分泌表达、包涵体表达、选用蛋白酶缺陷型受体。启动子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。其长度因生物的种类而异，一般不超过200bp。启动子是基因表达调控的重要顺式元件，具有如下特征：序列特异性;方向性;位置特异性;种属特异性。增强子（enhancer）:能够增强启动子转录活性的DNA序列。其结构类似于启动子，由1个或多个元件组成，每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。长50~1500bp，不同增强子具有不同功能，如在特定的细胞中或在特定的发育阶段激活相关的启动子。增强子的特性如下：双向性；重复序列；行使功能与所处位置无关；特异性；调控功能的普遍性。终止子（terminator）:终止转录的序列。衰减子（attenuator）：是基因表达的精细调节装置，它利用了原核生物转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧妙的特征序列和相应的RNA二级结构，对基因转录进行开关式的微调作用，从而保证原核生物在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个基底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等，如大肠杆菌色氨酸操纵子。绝缘子（insulator）：在真核生物基因组中，既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件。在果蝇和鸡的基因组中已发现多个绝缘子，它能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用。反义子：编码反义RNA的DNA称为反义子。反义RNA（antisenseRNA）是一类与特定DNA序列互补的小分子RNA。反义RNA广泛存在，功能主要有调节DNA复制、转录和翻译，以抑制蛋质合成为常见。可应用于沉默需要沉默的基因，尤其是疾病基因。RNA干扰（RNAi，RNAinterference)：由双链RNA启动，在多种酶参与下，经过一系列步骤（包括siRNA的形成和双链降解等）将同源RNA降解的现象。MicroRNA（MiRNA）：20～24nt的单链RNA，在进化上具有高度的保守性，通过与靶mRNA完全（植物）、不完全（动物）互补配对，促进RNA的降解或抑制翻译。miRNA和RNAi在生成机制、作用途径等方面关系密切，既有区别又相互联系。cDNA文库：以mRNA为模板，经HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/212470.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/184171.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"载体（常用噬菌体或HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/2956892.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/3853576.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/4474336.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/552529.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"特异性。基因组文库:通过克隆载体使某生物基因组的全部遗传信息贮存于一个受体的群体，即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗传信息，则称部分基因组文库或亚基因组文库。SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：mRNA中用于结合HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/24189.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"原核生物核糖体的序列。外显子(expressedregion):是真核HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/4579.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"生物HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/8563.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/955300.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/8563.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"基因序列，又称表达序列。既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/3851939.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"核苷酸序列。术语外显子也指HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/237708.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"编码相应RNA外显子的DNA中的区域。所有的外显子一同组成了HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/1015022.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"遗传信息，该信息会体现在蛋白质上。内含子（introns）:在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/3851939.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"核苷酸序列。术语内含子也指编码相应RNA内含子的DNA中的区域。内含子可能含有“旧码”，就是在进化过程中丧失功能的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/8563.htm"\t"http://baike.baidu.com/_blank"基因部分。正因为内含子对翻译产物的结构无意义，不受自然选择的压力，所以它比外显子累积有更多的突变。融合蛋白:重组但不改变其两个基因的阅读框的重组基因表达的蛋白。融合蛋白的表达效率较高，稳定性增加，具较高的水溶性和一定的生物学活性。HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/344949.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"包涵体:即表达外源基因的HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/1495623.htm"\t"http://baike.baidu.com/view/_blank"宿主细胞。限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）:一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。生物学意义：是生物细胞内限制性修饰系统的一部分，可防止外源DNA的入侵。限制酶的Star活性：在特定条件下，某些酶在非识别序列处切割DNA的现象称为Star活性。识别位点：限制性内切酶特异结合的核苷酸序列。限制性（物理）图谱：描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱。黏性末端:两链的断裂位置交错、对称地绕着一个对称轴排列所形成的断裂。平末端：两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中心所形式的断裂。同裂酶：识别序列相