仪器分析课程讲义第三章高效液相色谱分析目录高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的主要类型及原理高效液相色谱的分析原理第一节、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的特点：1）高效（15－35mPa）高压泵，高速，高压2）高效（柱效约为30000n/米）高效固定相-93）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10g，-11荧光：10g）二、高效液相色谱
方法
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的局限性1．成本高，且易引起环境污染2.缺少通用型检测器3.不能替代毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品4.不能代替中、低压柱色谱法，分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。?三、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相；柱效低（H↑，n↓）分析周期长、无法在线检测．HPLC：分离和分析柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）柱效高（H↓，n↑）高压泵输送流动相；分析时间大大缩短、可以在线检测2四、HPLC与GC差别主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别1．分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，仅能分析有机物的20%.?HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制。?分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，占有机物的80%。2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用3．操作条件差别GC：加温操作;HPLC：室温；高压（液体粘度大）第二节高效液相色谱法的主要类型及原理1、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph2、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph3、离子交换色谱ion-exchangechromatograph4、离子对色谱ion-pairchromatograph5、离子色谱ionchromatograph6、排阻色谱size-exclusionchromatograph7、亲和色谱(AC)Affinitychromatograph1、液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：各组分在固定相和流动相上的分配性能的差别。讨论：同气液分配色谱法相似，分离的顺序取决于分配系数的大小。不同之处在于气相色谱法中流动相的性质对分配系数影响不大，而液相色谱法中流动相的种类对分配系数却又较大影响。在液液分配色谱法中，为了避免固定液的流失，采用固定液和流动相的极性相反。?正相：流动相的极性小于固定相?反相：流动相的极性大于于固定相，正相与反相的出峰顺序相反?2、液-固吸附色谱基本原理：各组分在吸附剂上的吸附性能的差别固定相：固体吸附剂应用：对中等分子量的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；3、离子交换色谱基本原理：各离子组分在固定相上发生的反复离子交换反应能力的差别；固定相：阴（阳）离子交换剂流动相：pH缓冲溶液（酸性、碱性）应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸、蛋白质等。4、离子对色谱基本原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，控制溶质离子的保留行为使其两相之间进行分配；固定相：阴离子分离：采用烷基铵类.阳离子分离：采用烷基磺酸类，应用：分离分析强极性有机酸和有机碱。适用生化试样核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。5、离子色谱分离原理：离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。(无机离子的分析和应用)固定相：离子交换树脂流动相：无机酸或无机碱检测：电导检测器在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。离子色谱连续抑制装置图6、排阻色谱size-exclusionchromatograph原理：基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。保留时间：小分子>中等分子>大分子固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；35应用：可对相对分子质量在10-10范围内的化合物按质量分离。7、亲和色谱(AC)Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相表面配基存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱小结：分离类型选择液相色谱分离类型参考表相对分子量排阻色谱>2000样品溶于水水为流动相不溶于水非水流动相同系物分配色谱异构体吸附色谱不离解反相液液色谱不溶于水相对分子量<2000溶于水具有亲和性亲和色谱阴离子交换色谱可离解阳离子交换色谱离子对色谱离子色谱第三节高效液相色谱分析的原理及分离条件一、高效液相色谱法的理论基础1．涡流扩散项HPLC中该项与GC完全相同。式中，λ为填充不规则因子；颗粒平均直径。dp为填充物2．纵向扩散项由于液相中扩散系数要比气相中小4-5个数量级，HPLC中该项对于谱带扩张的影响可以忽略不计。HPLC的传质阻力项包括:固定相传质阻力(Hs)，移动流动相传质阻力(Hm)和滞留流动相传质阻力(Hsm)三项。3．传质阻力项(1).固定相传质阻力项?式中，df为固定液涂层厚度；Ds为组分在固定液中的扩散系数；Cs为常数(2)流动相的传质阻力项：?式中，dp为填充物平均颗粒直径；Dm为组分在流动相中的扩散系数；Cm为常数。(3)滞留流动相的传质阻力项：式中，Csm是与颗粒微孔和容量因子有关的常数。该项阻力主要与固定相的结构有关二、影响色谱分离的因素1.影响分离的因素与提高柱效的途径H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。降低传质阻力是提高柱效主要途径。改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2.流速流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。3.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作.(extracolumneffect)4.柱外效应是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽。可分为柱前和柱后两种。柱前展宽：主要由进样引起柱后展宽：是由接管和检测器流通池体积以及检测器响应时间等因素所引起。
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