第PAGE\*MERGEFORMAT#页，共5页测序技术地前世今生测序技术地进展历程fitifjirisMdukLuklluviSMHTi1HKW1：「：・•“訥加Mtwi詳mWf?CXW]h^ipi■甲样COMJ"|TiwTItTMWLJURUMirWl■^frH4fir\7MHMiZtIVbUkivtituomj第一代测序技术（Sanger测序）第一代DNA测序技术用地为1975年由桑格（Sanger）与考尔森（Coulson）开创地链终止法或者为1976-1977年由马克西姆（Maxam）与吉尔伯特（Gilbert）创造地化学法（链降解），在2001年，完成地首个人类基因组图谱就为以改进了地Sanger法为其测序基础；原理：ddNTP地3'无羟基，其在DNA地合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入肯定比例带有放射性同位素标记地ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTPddTTP），通过凝胶电泳与放射自显影后可以依据电泳带地位置与确定待测分子地DNA序列；qn^ij1s—-J：*M!|||K|"區m*ke_JdNTPddNTP■轩EW晞酣THEVU11
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口TAGCAACTATCG1TGA双脱氧法原理示意图dATPdGTPdCTFdTTP+ddTTPdATPdGTPdGTP+ddCT:dTPdATPdGTP4ddGTPdCTPdTTPdATP^ddAIPdGTPdGTPdTTPATddC-/t：IvJL?atph_hIL_zU-U・j一口■J咨淫荐fltTCGl■1GddAATCGTTddG-ATCGTddTATCGddT*AT'ddGATddC^ddTIdA=-■:■7:■LJMrSiM-引詢延长和合成阻断其次代测序技术（NGS）第一代测序技术地主要特点为测序读长可达1000bp，精确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面地缺点，严峻影响了其真正大规模地应用；经过不断地技术开发与改进，以Roche公司地454技术，illumina公司地Solexa，Hiseq技术与ABI公司地Solid技术为标记地其次代测序技术产生了；其大大降低了测序成本地同时，仍大幅提高了测序速度，并且保持了高精确性，以前完成一个人类基因组地测序需要3年时间，而使用二代测序技术就仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术就要短许多，大多只有100bp-150bp；1.illumina占全球75%以上,4步：Illumina公司地Solexa与Hiseq为目前全球使用量最大地其次代测序机器，以HiSeq系列为主，技术核心原理都为边合成边测序地方法，测序过程主要分为以下2第PAGE\*MERGEFORMAT#页，共5页^lu^tor90notationbysobdphasePCR[bridgeampii^cu：ik)in)s^qu^nelnQtryByn*i(Ml*withrnypn^MttrmMruttonil^hBEhEHUU■drldu(rHWrtuABlHDnn^fh■mHiFFCW^riWWIilJiquriiiEBvwdamnwftip^ichmlskqpEfttM1）构建DNA测序文库DNA分子用超声波打断成200bp-500bp长地序列片段，并在两端添加上不同地接头;2）测序流淌槽（flowcell）结构：Flowcell为测序地载体，课吸附DNA文库，每个flowcell有8条lane，每个lane有2行column，每行column有60个tail，每个tail经CCD镜头课捕捉荧光信号；第PAGE\*MERGEFORMAT#页，共5页I"Eli]訓齐直BQjmKjL<2^（Cdkirvh常艸帯舟』"啊・（bJ^L1M^CCD镜头摄•V*KBri£H■規齐科&0牛于狙pW+tKfi・JkSss■耳曳罠甲也MMI4S!3）成簇（cluster）NGS地核心技术特点，目地在于实现将单一碱基地信号强度进行放大，以达到取荧光地信号要求；大体原理网上都可查到，在此解答2大难懂得之处：一.可逆终止荧光dNTP（lllumina测序核心技术）荧光修饰dNTP可逆合成终止（包括用叠氮基团即起到了可逆终止作用与用不同荧光集团区别碱基信号地功能），为Illumina测序地最核心技术；cooed|'O-P-Q-P-0・P•■右IIt0OOT1.上图为修饰过地dCTP分子结构式，在核苷酸糖基3'位连一个叠氮基团（红色基团）；这个叠氮基团在链延长地时侯起到了阻挡聚合地作用（懂得见下图DNA复制时地5与3地示意图，下一个碱基合上时为：下一个核苷酸地5'连接到上一个核苷酸地3'0H，故假如下一个核苷酸地3带有叠氮基团而非自然状态下地0H时，下一个核苷酸就无法合上；）PiiiktDNAr-u0Tjo1P-C>P-Ci,V「」1oI'DNAD'^qffidrtriidruiphcaphirtc隠Ai科诚nr.JCiTkjrjp.bail;n竝dATP)n0—p^GIGiLO6o-liwrxKixpyn>phMp4ux<1I单Ch0Wr--
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