WTDstandardizationoffice【WTD5AB-WTDK08-WTD2C】胶内酶解质谱样品前处理胶内酶解质谱样品前处理-蛋白考染胶溶液配制：1、水：HPLC级；乙腈：HPLC级；乙醇：HPLC级；2、200mMNH4HCO3溶液：取NH4HCO3加水溶解并稀释到50ml。稀释4倍得到50mMNH4HCO3溶液，稀释8倍得到25mMNH4HCO3溶液；3、25mMNH4HCO3的50%的乙醇-水溶液（考染脱色液）：50%乙醇-水溶液和50mMNH4HCO3溶液等比例混匀；4、10%乙酸的50%乙醇-水溶液；5、DTT溶液：10mMDTT的25mMNH4HCO3溶液（ml，现配此浓度，-20℃保存须两天内用完）；6、IAA溶液：55mMIAA的25mMNH4HCO3溶液（mg/ml，现配此浓度，避光保存，-20℃保存须两天内用完）；7、Trypsin溶液：取储存于-80℃的分装浓缩酶溶液（浓度为100ng/ul（20ug到200ul），溶于50mMNH4HCO3溶液中）,用50mMNH4HCO3溶液稀释为10ng/ul，全程冰上操作；8、50％乙腈-水溶液（含5%三氟乙酸）；9、75%乙腈-水溶液（含%三氟乙酸）；10、%三氟乙酸-水溶液；11、50%乙腈-水溶液（含%三氟乙酸）。12、避光新鲜配置脱色液(银染)：50mMNaS2O3:15mMK3Fe(CN)=1：1混合取胶用超纯水清洗胶块2次，用手术刀片切下胶上目标条带，用手术刀片充分切碎(1mm3大小，用HPLC级异丙醇和水分别洗涤手术刀和镊子)。第一天：考马斯亮蓝染色凝胶的脱色把切碎的胶块置于管中（预先加入1ml考染脱色液，含25mMNH4HCO3的50%的乙醇-水溶液），室温震荡15-20min（在混匀仪中高速震荡混匀），重复2-3次，直至胶块无色，14000rpm离心1min,去上清。加入1ml10%乙酸的50%乙醇-水溶液在恒温混匀仪上室温震荡洗涤胶块2次，每次30分钟，去上清。加入1ml水，在恒温混匀仪上室温轻微震荡洗涤胶块胶块2次，每次5-10分钟，去上清。加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓缩功能，下同）。Destain银染凝胶的脱色1.加500μl脱色液，室温避光震荡5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复1～2次至胶块去除银染颜色。2.加500μl50mMNH4HCO3，震荡5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复1～2次至溶液无明显黄色。再加500μl50%乙腈，震荡5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液。3.加500μl50mMNH4HCO3，震荡5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液。再加1ml50%乙腈，震荡5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液，至胶块呈白色。5.加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓缩功能，下同）。还原烷基化5.加入30-60ul(可适当多加，没过胶条)DTT溶液，56℃恒温混匀仪上震荡孵化1小时，冷却至室温，离心去上清，真空抽干10min。6.加入30-60ulIAA溶液(体积与DTT大体相同)，暗处室温孵育45min，去上清。加1ml50mMNH4HCO3溶液震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。加1ml水震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。加乙腈1ml漩涡混合洗5min，14000rpm离心1min,去上清，真空抽干10min。酶解把胶粒转移至的离心管中，加入25～35ulTrypsin溶液（酶与底物蛋白的质量比约为1:20～1:50），冰上放置10min，中间检查确保胶块完全浸泡在酶液中，如果没有充分吸胀，补加一定量的酶液（酶液体积根据胶块大小确定，稍多于胶水溶液状态体积）待溶液被胶块完全吸收，加10～20ul50mMNH4HCO3，37℃酶解16-20小时。第二天：肽段提取10.吸出酶解液至新的离心管中，加2-3倍于胶体积的50％乙腈-水溶液（含5%三氟乙酸）至原管中（视胶条大小而定），恒温混匀仪室温震荡15min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清转移至同一离心管中，盖管标记。11.加2-3倍于胶体积的75%乙腈-水溶液（含%三氟乙酸）中，恒温混匀仪室温震荡10min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清合并至上管中。12.加2-3倍于胶体积的乙腈中，恒温混匀仪室温震荡5min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清合并至上管中。13.合并3次提取液，真空干燥，-20℃保存。保存胶条，备用（防止酶解不充分）。14.样品制备完成，溶解样品在10ul%三氟乙酸-水中。微量蛋白及肽段溶液的Ziptip脱盐1.准备：(1)、平衡管1：乙腈（1ml/支，离心管）；(2)、平衡管2：50%乙腈-水（含%三氟乙酸）（1ml/支，离心管）；(3)、平衡管3：%三氟乙酸-水（1ml/支，离心管）；(4)、脱盐管：%三氟乙酸-水（1ml/支，离心管）；(5)、洗脱液管：50%乙腈-水（含%三氟乙酸）（10ul/支，离心管，如样品含疏水性肽段较多，可以增加乙腈至75%）2.具体操作如下：（1）平衡：乙腈冲洗ziptip1次（吸取-废弃至管外低尘纸上），50%乙腈-水冲洗ziptip1次（吸取-废弃至管外低尘纸上），%三氟乙酸-H2O冲洗ziptip5次（吸取-废弃至管外低尘纸上）；（2）吸附样品：加10uL%三氟乙酸-水充分溶解，低速离心，ziptip反复吸打样品15-20次；（3）冲洗：%三氟乙酸-水冲洗ziptip3次（吸取-废弃至管外低尘纸上）；（4）洗脱：用10uL洗脱液反复吸打ziptip15-20次。(5)复溶：真空抽干，在洗脱液管中加入%甲酸-水6ul，在旋涡混合仪上充分溶解，待质谱分析。蛋白质前处理注意事项注：上述过程需要：洁净的环境，实验服、口罩、帽子、无粉丁腈或乙烯基手套（严禁使用乳胶手套）操作，实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带口罩和帽子；尽量避免蛋白质点和相关溶液与外界空气接触,避免可能造成的污染。对于鉴定修饰样品，蛋白纯度和丰度越高越好，需要尽可能的提高蛋白纯度和丰度。胶条保存在离心管中，加入相当于胶条高度1/3的水，在胶条处理之前保持湿润状态，防止胶条变干，胶条保存放在4℃。所有离心管、枪头均为进口产品；所有试剂均为进口分析纯，实验用水均为进口HPLC级；每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。加酶之前，可不用换移液枪头；但在加酶之后，必须每管换枪头，因为酶将蛋白释放出来；Ziptipu-C18多肽吸附量1-2ug(鉴定修饰),ZiptipC18多肽吸附量1-5ug（其他）。尽可能在最短的时间内完成脱盐前的步骤，不建议中间步骤停顿过夜，含盐蛋白干粉相对稳定，脱完盐后须尽快进行质谱分析。
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