第二章基因工程与食品产业

第二章基因工程与食品产业第一节基因工程概述第二节工具酶和基因载体第三节基因工程的基本技术第一节基因工程概述一、基因工程的概念1.基因工程：是用人工方法把不同生物的遗传物质分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后转入宿主细胞或个体中高效表达，最终获得所需要的基因产物。转基因操作的基本原理示意图基因工程含义通过体外DNA重组和转基因等技术将外源基因导入受体细胞，有目的地改造生物，短时内创造出更完善的新的生物类型。广义上指产业化设计与应用，包括上、下游技术两大部分，倾向于工程学范畴。优点：打破了常规的物种间界限（原核与真核生物之间、动植物之间、甚至人与其他生物之间），使遗传信息进行重组和转移。食品基因工程：指利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和形状，提高食品的营养价值、贮藏加工性状以及感官性状的技术。2.基因工程的主要内容：分4步：（1）在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含特定的基因片段或人工合成目的基因，并制备载体（质粒或噬菌体）。（2）把获得的目的基因与制备好的载体用DNA连接酶连接成重组体。（3）把重组体导入宿主细胞。（4）筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体。3.基因工程理论依据①基因有共同的物质基础：有遗传功能的特定核酸序列：DNA片段或RNA。②基因可切割：存在间隔序列（重叠序列的基因也可切出）。③基因可转移：可在染色体DNA或不同染色体之间转移，基因组也可重组。④多肽与基因之间存在对应关系。一种多肽对应一种基因。根据表达产物的性质可检查基因的转移或重组。⑤遗传密码通用。三联密码子（少数除外）与氨基酸相对应，所有生物都相同，只要具备转录翻译条件均能转译出原样的氨基酸。⑥基因可复制传递遗传信息。重组基因可传代，获得相对稳定的转基因生物。三、基因工程的基本技术路线二、基因工程研究发展史1.准备阶段1944年美国Avery等细菌转化 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 DNA是基因载体。1953年Watson和CrickDNA双螺旋模型。1958～1971年先后确立中心法则,破译64种密码子，揭示了遗传信息的流向和表达。20世纪60年代末70年代初：发现限制性核酸内切酶和DNA连接酶，实现DNA体外切割和连接。1972年首次构建出重组DNA分子。Whatisthegene?BasicpropertyReplication复制Expression表达DNADoubleHelixmodelMutation变异1952J.WatsonandF.Crick★磷酸与脱氧核糖彼此通过3‘、5‘-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。★磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。2.基因工程问世1973年首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，证实真核基因可转移到原核生物细胞并表达。3.基因工程的迅速发展阶段。构建了多种供转化原核生物和动、植物细胞的载21世纪初是基因工程应用研究的鼎盛时期，医、体，获得了大量转基因菌株。农、牧、渔的等产品都会使用基因工程技术。1980年：显微注射培育出第一个转基因动物—转基因小鼠。1983年：农杆菌介导培育出第一例转基因植物—转基因烟草。第二节工具酶和基因载体DNA重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具，限制性核酸内切酶在重组DNA技术中有重要地位。一、基因工程的工具酶（一）限制性核酸内切酶核酸酶可分为两类：①核酸外切酶：是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；②核酸内切酶：则从核酸链中间水解3'，5'磷酸二酯键，将核酸链切断。一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖1.限制性内切酶的发现1962年，因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断；同时又伴随有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶，能使自身核酸特定序列上的碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化修饰，就会被细胞的核酸酶所水解。这样细胞就构成了限制——修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA。DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。2.限制性核酸内切酶的命名按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：1.EcoRⅠ是从大肠杆菌的R株中分离出来。2.从流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。限制性核酸内切酶命名规则：生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称基本名称+菌株名的字母+罗马字母（发现顺序）HindIIIHaemophilusinfuenzaed株中的第三个酶EcoRI基因位于Escherichiacoli抗药性R质粒上E细菌属名coR细菌种名种菌株类型I有几种限制酶3.限制性核酸内切酶的分类（1）Ⅰ型限制性核酸内切酶兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，随机切断在识别位点以外的DNA序列。这类酶的作用需要Mg2+，腺苷甲硫氨酸及ATP。此酶是多聚体。有EcoB和EcoK两种，具有催化限制性切割和修饰核苷酸2种功能。（2）Ⅱ类限制性核酸内切酶能识别特异序列，在特异位点水解双链DNA中每一条链上的磷酸二酯键。酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。（3）Ⅲ类限制性核酸内切酶2+只由一条肽链构成，仅需Mg，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。Ⅱ型酶：在遗传工程中应用最广泛。①有特异识别和切割的序列部位，被切割的DNA分子形成单链的断裂；②断裂的部位通常具有粘性末端，使其能够重新连接；③内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成。★共同的特性：?只切割双链DNA分子，不切单链DNA；?每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性；?需要镁离子激活等。限制性核酸内切酶的作用大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5'磷酸基和3'羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同。①产生3'突出粘性末端:EcoR：②产生5'突出的粘性末端：PstⅠ：③产生平末端:NruⅠ限制性内切酶EcoRⅠ对DNA分子的切割工具酶a)CohesiveendRE----GAATTC--------CTTAAG----限制性内切酶EcoRIEscharichiacoliRy13first----GAATTC--------CTTAAG---限制性核酸内切酶名称BamHⅠClaⅠEcoRⅠHindⅢHindⅡKpnⅠNotⅠPstⅠSalⅠSau3AⅠSfiⅠSmaⅠXbaⅠXhoⅠ识别序列和切割点G↓GATCCAT↓CGATG↓AATTCA↓AGCTTGTPy↓PuACGGTAC↓CGC↓GGCCGCCTGCA↓GG↓TCGAC↓GATCGGCCNNNN↓NGGCCCCC↓GGGT↓CTAGAC↓TCGAG（二）DNA连接酶将两段DNA拼接起来的酶。特点：能催化DNA相邻的5'磷酸基和3'羟基末端之间形成磷酸二酯键，将单链缺口封合。如：T4DNA连接酶，大肠杆菌连接酶。（三）DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有5'3'DNA聚合酶活性，也有3'5'外切核酸酶活性。2.T4噬菌体DNA聚合酶3.耐热DNA聚合酶（Taq）用于：（1）DNA测序；（2）PCR对DNA片断进行体外扩增。（四）反转录酶（reversetranscriptase）★反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，所以又称为依赖于RNA的DNA聚合酶。★反转录酶在遗传工程中的主要用途是以mRNA为模板合成cDNA。酶限制性核酸内切酶Ⅱ主要用途识别DNA特定序列，切断DNA链①缺口平移制作标记DNA探针②合成cDNA的第二链③填补双链DNA3'凹端④DNA序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 DNA聚合酶Ⅰ或其大片段耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶等）DNA连接酶多核苷酸激酶末端转移酶聚合酶链反应（PCR）连接两个DNA分子或片段催化多核苷酸5'羟基末端磷酸化，制备末端标记探针在3'末端加入同质多聚物尾DNA端酶ⅠRNA酶A磷酸酶降解DNA，在双链DNA上产生随机切口降解除RNA切除核酸末端磷酸基二、基因工程载体?定义：是指能有效地运载外源DNA片段进入受体细胞内的可自主复制的DNA片段。即载体和外源DNA在体外组成重组DNA分子，进入受体细胞后能进行自我复制。?载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。基因工程载体一般需具有以下特点:①在宿主细胞中能够独立自主地复制；②容易从宿主细胞中分离纯化；③载体DNA分子中有一段非必需区域，插在该区域的外源基因可以像载体的正常组分一样进行复制和扩增；④具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记⑤具有很强的启动子、阻遏子和终止子。基因工程中常用的载体主要有：①质粒（plasmid）载体;②噬菌体载体；③病毒载体；④上述载体相互组合或与其他基因组DNA组合成的载体。这些载体可分为克隆载体和表达载体，其中表达载体又分胞内表达和分泌表达两种。根据载体进入的受体细胞不同，又分为原核细胞和真核细胞表达载体。在基因工程操作中，根据运载的目的DNA片段大小和宿主需要选用合适的载体。（一）质粒(plasmid)载体质粒是常用的克隆载体，广泛存在于包括细菌、酵母在内的多种微生物中，在宿主细胞的染色体外以稳定的方式遗传。它是一种双链环状的DNA分子。独立地自我复制及转录。质粒◆质粒(plasmid)是细菌染色体外存在的一种能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，大小1kb～200kb。?质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。?一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。?质粒DNA复制与宿主之间的关系，可分为“严谨型”和“松弛型”。“严谨型”质粒在每个细胞中的拷贝数通常1~3个，而“松弛型”通常在10个以上，可高达200个拷贝。◆一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。作为克隆载体的质粒应具备以下特点:①分子量小，稳定存在，较高拷贝数；②有遗传标志;③内切酶位点。质粒分为多种类型：F质粒R质粒降解质粒1.质粒载体pBR322长度为4.3kb，含有氨苄青霉素和四环素的rr抗性基因(Amp和Tet)。在氨苄青霉素和四环素的抗性基因中间有限制性内切酶位点，便于外源基因的插入和筛选。有一个复制的起始位点，保证只在E.coli中复制。基因工程载体质粒载体酶切图谱示意图2质粒载体pUC19pUC系列质粒，全长2.6kb，由pBR322的氨苄青霉素抗性基因、复制起始位点以及大肠杆菌lacZ基因片段构成，在lacZ基因中加入了多克隆位点，供外源基因的插入，可以进行颜色筛选。3酵母质粒载体4农杆菌质粒载体土壤农杆菌Ti质粒：通过感染植物的伤口，诱发伤口组织形成冠瘿瘤，同时在瘤内合成冠瘿碱。Ti质粒有4个区：T-DNA转移区vir区，毒性区细菌吸收利用冠瘿碱区其他区域农杆菌质粒载体（二）噬菌体载体???噬菌体是侵染细菌的病毒。用做克隆载体的噬菌体有两种:λ噬菌体,M13噬菌体。λ噬菌体是线状双链分子，是温和噬菌体。进入大肠杆菌后即通过粘性末端的碱基配对形成环状分子，也可以整合进入宿主细胞基因组中。在某种营养条件或环境协迫时进入裂解循环。噬菌体载体λ噬菌体的基因组头尾必需基因非必需基因在基因组中，接近40%的区域是非必需的，可以将这部分切除，在此区域插入外源DNA片段。λDNA可以作为载体，通过替换自身序列的方式携带外源DNA。第三节基因工程的基本技术1.2.目的基因的获得与序列分析目的基因序列与载体的连接，制成DNA重组体将DNA重组体导入宿主细胞目的基因序列克隆的筛选与鉴定3.4.1．从生物体的基因组中分离目的DNA序列。包括DNA的纯化技术，酶促消化或机械切割，以游离目的DNA序列。2．建立人工的重组DNA分子，即将目的基因插入一能在宿主细胞中复制的DNA分子，即克隆载体。3．将重组DNA分子转到合适的宿主中，如大肠杆菌。4．利用细胞培养技术，培养筛选转化的细胞。一个转化的宿主细胞能生长并产生遗传上相同的克隆细胞，每个细胞都携带着转化的目的基因，此技术就是常指的“基因克隆”或“分子克隆”。（一）获得目的基因的方法目的基因要转移或改造的基因。它：就是人们所需含有一种或几种遗传信息的全套密码。的目的基因有：苏云金目前广泛提取使用杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分限制酶目的基因提取目的基因的方法1.鸟枪法?是一种由生物基因组提取目的基因的方法。该法类似于鸟枪发射散弹。?具体操作：用若干个限制酶处理一个DNA分子，将它切成若干个DNA片段。这些片段的长度相当于或略大于一个基因。然后，将这些不同的DNA片段分别与适当的载体结合，形成重组DNA，再将它导入到相应的营养缺陷型细菌中。?缺点：专一性较差，有时分离出来的并非一个基因，但由于操作简便，仍然广泛采用。例如，要提取维生素B1合成酶基因时，就要用维生素B1的营养缺陷型细菌(它在不含维生素B1的培养基上不能生长)。把整合了不同DNA片段的营养缺陷型细菌分别接种到不含维生素B1的培养基上进行培养，只有整合了含有维生素B1合成酶基因的DNA片段的细菌才能正常生长。最后，把这些细菌中的这段DNA分离出来，再进行一系列的操作，就可以获得维生素B1合成酶基因。直接分离基因——鸟枪法将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。用限制酶切断成许多片段2物理化学法该法利用核酸DNA双螺旋之间存在的GC配对，AT配对这一特性，从基因组中分离目的基因的方法。如：密度梯度离心法，分子杂交法等。3.根据已知的氨基酸序列合成DNA该方法是建立在DNA序列分析基础上的。当已知一个基因的核苷酸序列，可以按图纸先合成一个个含少量（10～15个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补的关系形成双链片段，然后用连接酶把双链片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整的基因。这种方法专一性最强，用计算机自动控制的DNA合成仪，进行基因合成，使基因合成的效率大大提高。4.反转录法首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖体提取出来，分离出mRNA，然后以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。这种方法专一性强，但操作过程比较麻烦，mRNA很不稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。5.PCR扩增法（聚合酶链式反应）1985年，美国一公司开发的专利技术。能简便、快速地在体外对特定的DNA进行扩增。1993年，获得诺贝尔化学奖。PCR技术给分子生物领域带来一场变革。PCR的反应体系包括：（1）与目的基因的DNA双链两端互补的DNA引物。（2）热稳定性的酶，如TaqDNA聚合酶。（3）dNTP。（4）模板的DNA序列。（5）buffer。PCR反应的过程（1）变性。模板95℃，双链DNA单链DNA。（2）退火。温度降至55℃，使一对引物能分别与变性后的两条模板链配对。（3）延伸。升温至Taq酶作用的最适温度72℃，以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复循环至30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。PCR法PCR法（二）DNA序列测定DNA序列分析：指对一段DNA分子或片段的核苷酸排列顺序测定，即测定组成DNA分子的ATGC排列顺序。1977年，F.Sanger发明双脱氧序列分析法（末端终止法）。双脱氧末端终止法DNA序列分析的原理如果在反应物中加入一定量的某一种2',3'-双脱氧核苷酸,例如ddTTP，就会在应当掺入dT的位置掺入ddT。由于ddT核苷酸的3'碳原子不含有羟基而不能和下一个核苷酸的5'碳原子上的磷酸根结合形成磷酸二脂键，所以DNA链就不能继续向后延伸。Sanger据上述原理设计了DNA测序的末端终止法。测序时要进行4个独立的反应，每个反应中有一种dNTP用32P标记，并且在4个反应中分别加入一定比例的ddATP,ddTTP,ddGTP和ddCTP。反应一段时间后，每个反应中都会生成一系列由对应的那种ddNTP结尾的长短不一的DNA片段，而且这些片段的5'端序列是相同的。最后，将反应物变性后用电泳分离，经放射自显影后就可以读出DNA的碱基顺序。二、目的基因与载体的连接因相同的限制酶切割用与提取目的基质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连拉酶的作用下连接形成重组DNA分子。三、重组DNA向受体的转化导入扩增必须将它导入受体细胞并要让目的基因表达，进行扩增。达产物时，通常以大肠杆为获得目的基因的表菌等无害易得的细菌为受体。为改进某种生物时，将欲改进的生物细胞为受体。重组DNA向受体细胞的导入方法有：1.转化：将重组质粒导入受体细胞，使受体菌的遗传性状发生改变。2.转染：用携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法。电转化法：（电穿孔法）对受体细胞进行短暂、高压的电泳脉冲，质膜形成nm微孔，DNA能直接通过孔，或作为孔闭合时膜组分重新分布而进入细胞质中。3.重组质粒1）重组DNA向受体的转化转化法感受态的出现转化因子的吸附和渗入转化因子的整合（1）感受态的出现感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。细菌的感受态只出现在特定的生长条件和生长阶段。采用人工的方法诱导产生感受态：把供试的细菌由丰富的培养液转到贫乏的培养2+液中；利用Ca；改变温度等方法。（2）转化因子的吸附和渗入?转化因子：是离体的DNA片断。?过程：双链DNA片段与感受态受体菌细胞表面的DNA结合位点结合；在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成小片段；在另一核酸酶作用下，把双链解开，推动另一条链进入细胞。（3）转化因子的整合来自供体菌的DNA片段与受体菌核染色体上同源区段配对、重组，形成一小段杂合DNA，受体菌染色体复制，杂合区也跟着复制。2）转染法电转化仪??功能：培养细胞，培养器官，培养组织，活体组织的电转化。精确的低电压控制：数字式操作面板，提高脆弱受体细胞生存率和转化效率。每次脉冲自动检测脉冲电流，确保输出电流的准确性。3.基因枪法：将DNA吸附在微型子弹表面，通过放电或机械加速，使子弹射入完整的细胞或组织内。4．显微注射法直接注射入细胞质或细胞核内显微注射法—利用显微操纵器，将DNA直接注射到细胞核中。显微注射穿刺法5.脂质体导入法：?脂质体：是由脂质双分子层组成的环形封闭囊泡，无毒，无免疫原性。原理：需将DNA或RNA包囊于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。??在水中，磷脂分子亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空中，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体。阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹，形成DNA—脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，将DNA传递进入细胞。?三、重组体的筛选与外源基因的鉴定1.重组体的筛选在植物基因工程中，转化细胞的筛选常采用抗生素抗性基因或抗除草剂基因的选择法。2.重组体的鉴定这是一种快速简易的方法区分转基因/非转基因生物。（1）报告基因的检测法定义：在构建目的基因时将一种报告基因（如GUS基因）构建在一起，当目的基因转化受体细胞时，报告基因一同被转入。这种报告基因是受体本身不存在的，有易于检验的表型。GUS基因：即β－葡萄糖苷酶基因该酶能降解葡萄糖苷键，反应后根据分光光度计法、荧光分析法等测定。?质粒图谱及质粒构建启动子外源基因终止子启动子报告基因终止子（标记基因）目的片段选择标记载体报告基因的种类1.2.3.4.5.6.新霉素磷酸转移酶（Neomycinephosphotransferase–II,NPTII)基因氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicolacetyltransferase,CAT）基因潮霉素磷酸转移酶（Hygromycinphosphotransferase,Hpt）基因β–葡萄糖酸苷酶（β–Glucuronidase,GUS）基因荧光素酶（Luceferase,Luc）基因抗除草剂（Basta,Bar）基因β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒产品包装:200次产品价格:368.00元β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒，是以无色的ONPG为底物，在β-半乳糖苷酶的催化下生成黄色的onitrophenol，然后通过酶标仪或分光光度计在420nm波长附近测定吸光度，从而实现对β-半乳糖苷酶活性的测定。2.重组体的鉴定（2）目的基因分子杂交检测法?探针与样品进行核酸分子杂交，能进一步证明目的基因的存在，转录及表达程度。基因探针：是一段与目的基因互补的核酸序列，是DNA/RNA。?分子杂交分为：点杂交SouthernblotNorthernblotWesternblot