（Excellenthandouttrainingtemplate）BrdU染色原理和步骤BrdU染色原理BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活细胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中（细胞周期S期）。这种掺入可以稳定存在，随着DNA复制进入子细胞中。BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。活体注射或细胞培养后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。因组织细胞内无内源性Brdu存在，所以Brdu应用较广掺入双链DNA内的Brdu，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与抗Brdu抗体反应，需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。改进和发展由于盐酸和蛋白酶处理等可引起抗原或组织形态发生变化。为此，Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体（Bu—1），其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应，因为培养液上清中含有DNA酶，可分解双链DNA，显露Brdu，达到染色目的。采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—盐酸处理，亦得到了良好的染色结果。用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时，首先应染色其它抗原物质，最后显示Brdu。通常在第一种抗体呈色后，再经1%戊二醛固定5～10min，重复染色程序，均可获得较满意的染色结果，分裂细胞核呈棕褐色；显示其它抗原用ALP标记抗体，则细胞浆为红色（FR）或蓝色（FB）操作步骤（1）（1）细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35mm培养皿中（内放置一盖玻片），培养1d，用含0.4％FBS培养液同步化3d，使绝大多数细胞处于G0期。（2）加入BrdU（储液：1.0mg/ml,终浓度为0.03μg/ml），37℃，孵育40min。（3）弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。（4）甲醇/醋酸固定10min。（5）经固定的玻片空气干燥，0.3％H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。（6）5％正常兔血清封闭。（7）甲酰胺100℃，5min变性核酸。（8）冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。（9）按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。BrdUstainingprotocolMaterialsandreagentsHydrogenchloride(HCl),1Mand2MBoratebuffer0.1MBorax(sodiumtetraborate)38.1g/liter,pHto9.0Phosphate-bufferedsaline(PBS),pH7.4,with0.1%TritonX-100Method1.Sectionsofparaffin-embeddedtissuesshouldbede-waxedbeforeproceeding.2.IncubateinHCl(1M)for10minonicetobreakopentheDNAstructureofthelabeledcells.3.ThisisfollowedbyHCl(2M)for10minatroomtemperature,then20minat37°C.4.Immediatelyaftertheacidincubations,neutralizebyincubatingthesamplesinboratebuffer(0.1M)for10minatroomtemperature.5.WashinPBS(pH7.4),0.1%TritonX-1003times,5minperwash.6.Continuewithstandardstainingprocedureasdescribedintheimmunohistochemistryandcytochemistryprotocols.
注意事项
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1.BrdU配制方法：10mg溶于10ml双蒸水，4℃下避光保存2.BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU粉尘。BrdU染色的进化---EdUEdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，广泛应用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA损伤修复、病毒繁殖等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及各种药物的细胞增殖及活力筛选实验。演讲结速，谢谢观赏！Thankyou.
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