细胞培养注意事项

无菌操作基本技术实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminarflow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带岀工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移岀，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少ClassII）。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。定期 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 下列项目：CO2钢瓶之CO2压力CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。水槽可添加消毒剂（Zephrin1:750），定期更换水槽的水请问工作浓度的胰酶是不是应保存在-20度？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是几个小时就会失去活性？平时放在-20度，分装在50毫升螺口管，用时拿一管放4度用。认真按照操作规程进行实验，一般不大会导致污染，很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败，粉末培养基配制好后（加了血清），一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，但我在过去的4年里一直是作原代细胞培养的，细胞娇弱，经验表明放置时间不宜过长。关于实验用品的清洗与消毒，我的经验是：用过的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上,然后加少许清洗剂，以超声波洗涤30min左右，（如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净），捞岀晾干，再在铬酸洗液中浸泡6-18h（或过夜）后，自来水清洗10-15遍，双蒸水清洗3-4遍，晾干，高压消毒后即可使用。许多塑料制品也可以高压消毒，例如培养瓶盖，胶塞，吸头等。不能用于高压的一般均已制成一次性作用的商品了，当然如果money有限，如进口的培养板、皿等，也可以重复使用1-2次，我当时使用方法是将其完全清洁后，使用前在紫外灯下敞开照射1-1.5h即可，我做过多次，没有出现问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。塑料培养瓶由于清洗消毒不便，最好不要重复使用，如一定要重复用，可用环氧乙烷等消毒，（消毒后一定要放置半年以上方可使用）在光镜下，上皮细胞通常呈铺路石”样排布，细胞之间有拉丝现象（即距离较远的细胞可以通过细长的触手相连），细胞有成片生长的特性。而间质细胞通常呈梭形，没有有成片生长的特性，细胞之间的联系不紧密。但是细胞的形态特征会因为生长条件的改变而改变，如HeLa细胞是上皮细胞，但是在酸性培养条件下会变为梭形。上皮细胞之间都有特征性的紧密连接（桥粒）结构，因此可以通过观察培养细胞的超微结构来判断细胞的类型，如果有紧密连接，就必然是上皮细胞。这是一锤定音的证据。注意不要把细胞消化下来做电镜，要用细胞刮刮下来后做电镜。此外每一种上皮细胞都有其特征的细胞角蛋白的表达（cytokertin,CK），可以查一下子宫内膜腺上皮细胞表达的CK分子，然后进行免疫细胞化学的鉴定。，细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能是产生脱壁现象的原因，后来我重新测了一下培养基，为7.5左右，我用灭菌的HCL调了一下，培养基颜色变成淡红透亮，再次培养，发现细胞贴壁比较好了，搏动效果也不错，因此，我以后每次培养前都要重新调好PH值，我觉得很多因素是能影响PH值的血清质量不好，影响了细胞生长。所以，我认为以后养细胞，用的血清浓度最好是每批次血清都摸一下，不一定要以参考文献为准，毕竟国产的血清质量差异比较大啊。细胞无菌操作是关键，对于配制培养液时，有些人为了让培养粉充分溶解，搅拌4小时或更长时间。其实这完全没有必要，一般培养基的固体组分还是易溶于水的，搅拌的时间长了会增加污染机会，虽然后来滤过除菌了，但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉？细菌的代谢是很快的，甚至在常温下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的经验就是搅拌30min-60min就把它过滤。另外关于培养基的pH问题，一般按照说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 操作，加入所说的NaHC03量，与预计的pH不会有什么距离，也就是说基本上不用调pH，如果相差大，要考虑三蒸水的质量是否有所下降，当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH，只是用试纸检测一下pH，观察一下培养基的颜色。（1）东西一定要用自己的。既不要借别人的，也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范，因此相互之间串着用，很容易造成交叉污染。（2）我习惯口对口倒液体，在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单，越能防止污染。而且还能节省很多吸管。（3）一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路，又出工作间拿东西，这样增加了污染的机会。（4）整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了，最好不要接。我一般操作的时候将手机关了，手机声音响起，好烦躁。（5）我一般开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后，温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水域锅那岀后，最好找个毛巾插干上面的水。（6）操作前要洗手，用75%酒精搽手。用完操作台，要打扫卫生。细胞要经常冻存，我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了，扔掉，重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下，细胞并不是因为污染了，才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。我一般是不加双抗的，只要注意，不会污染。过滤时不要用枪吹细胞!!如果用力吹，筛网就像刀片一样，把你的细胞全部切碎!!.刷玻璃器皿的过程：初洗、泡酸（一天）、自来水冲洗（10遍）、纯化水冲洗（3遍）、注射用水冲洗（3遍）。感觉过于苛刻，自来水只冲洗3遍。被老师发现后，一阵痛批，才知道这是极其关键的一步，残留的酸可能会抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，痛失辛苦得来的细胞，心血付之东流。无知不能无畏，一定不能大意。做好准备工作。不要急于投身到细胞培养中去，要先设定 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 ：步骤，工具，试剂。特别是将细胞用于大规模生产时，尤其如此。eg.经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态，如果准备多了，用不完的就得重新灭菌，耗费能源、占用灭菌空间，不值得；干热灭菌需要一天的时间，当器皿准备不足时，只能干着急，错过了最佳操作时间，也许得很久才能将细胞状态再调整好。对于骄气的细胞，我一般都是第一天处理完后，加少量培基（够盖住瓶底部），第二天换液，以免死细胞和碎片对活的产生不良影响。新配的培养基直接用很清亮，但是在-20度保存一段时间后再溶解就要岀现很多杂质，用37度水孵育没有效果，握在手里不停摇动非常有效。其实对于操作熟练的人来说，污染并不是我们想像那样容易岀现，园子里很多人都问否污问题，而培养基的PH值往往被忽略，而且大多数人都习惯于一次配制1升培养基，分装成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在—20度保存，很容易岀现结晶，镜下看就是一些杆状的物资，有时候晃动培养基，肉眼就可以看到很多沉淀，这就需要我们在用之前好好摇匀了。操作中的安全：a。我犯的一个巨经典的错误至今难忘，刚做时酒精擦手，擦镊子，湿淋淋的就拿镊子过火，结果。。。火顺着镊子着到手上，虽然不怎么热，可是我手上的汗毛啊，555，都被烧了。这个错误以后再也没犯。b。过完火的试管口一定不能摸，时刻记着只拿试管的下1/2。c。给酒精灯加酒精永远记住不要拿酒精灯口那个灯心管，否则终身难忘。d。当酒精灯岀现什么意外时一定要镇静，先让他着一会可能没事，不要慌乱中打坏别的东东。e。离心机尤其高转速时，配平当然要牢记，可是一定要检查一下离心机里还有没有其他东东（有一次我离东西，着急，放进去刚离一会我就觉得声音不对，打开一看里面竟然有一根别人没有拿岀来的小管子）。还有一次配完平就打开离心机盖准备离心，结果吓个半死，原来别人正在离心，幸好管子没飞岀来'I1细胞冻存：当细胞状态好，或者代数比较早，一定要大量冻存，不要吝惜暂时的大批使用血清，当细胞状态不好，长不起来的时候，马上取出来复苏，省时省力，不要去尝试努力恢复状态不好的细胞，费时间也费血清，会令你痛苦不堪。另外冻存的细胞不要放到一个地方，-80度，液氮（甚至不同的液氮罐）都放一点，谁也不敢保证不出意外，冰箱也可能有化的时候（我们-20度冰箱就化过），都放在一块容易全军覆没。按照试剂的保存标准保存，象血清、胰酶等没开封的-20C，开封后-4C保存一般不超过7天（用完它吧，不然浪费了）5、一定要弄清楚每个组分的作用，特点，比如NaHCO3容易分解，因此培养基在过滤除菌时pH会上升，一般是0.1-0.3，所以在过滤之前，要把培养基的pH调低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特点，就不会做相应的处理，那么培养基不符和要求，细胞就长不好台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。