《生物化学》 PPT课件

生物化学Chapter1生物化学导论生物化学是研究生命分子和生命化学反应的科学，是运用化学的原理在分子水平上解释生物学的科学。它的主要研究范围包括这样几个方面：生物分子的化学结构和三维构象；生物分子的相互作用；生物分子的合成与降解；能量的保存与利用；生物分子的组装和协调；遗传信息的贮存、传递和表达。 Section1生命、细胞和生物分子分子是无生命的,然而分子却可以以适当的数目和方式构成生命。生命系统因有其特殊性质而与非生命系统不同。它们能生长、运动，能完成难以置信的代谢化学反应，能对环境的刺激作出应答以及能准确地进行自我复制。尽管生命存在着惊人的多样性、存在着生物结构和维持生命必需的机制的复杂性，但是生命的功能最终是可以用化学的原理来解释的。一、生命系统的独特性质●生物最显著的性质是它们具有复杂的结构和高度的组织形式。●生命系统能活跃地进行能量转换，生物高度组织化的结构和生命活动的维持依赖于从环境捕获能量的能力。被生物利用的能量形式是特殊的生物分子。ATP和NADPH是其中最重要的富含能量的生物分子，代表着生物在化学上可利用的能量的贮存形式。●生命系统具有显著的自我复制能力。生物能一代一代地繁衍与它们自身相同的后代。 二、生命分子　　生命物质的元素组成明显不同于地球外壳元素的元素组成。H、O、C和N构成了人体原子总量的99%以上，其中大多数H和O以H2O形式出现。　　　H、O、C和N的什么样的性质使其结合成适合于生命的化学？是它们通过共用电子对形成共价键的能力。此外，H、C、N和O是元素周期表中最轻的元素。由于共价键的强度与所涉及原子的原子量是成反比的，因此，H、C、N和O彼此间能形成最强的共价键。两种其他能形成共价键的元素磷和硫也在生物分子中起着重要的作用。 1、生物分子是含碳的化合物　　所有生物分子都含有碳。碳的优势是由于它通过共用电子对形成稳定的共价键方面的多面性。通常与碳以共价键相结合的原子是碳本身以及H、O和N（图1—1）。　　碳的共价键有两个特别值得注意的性质。一是碳与自身形成共价键的能力，另一个是被键合碳原子周围的四个共价键的四面体性质。这两种性质对于碳所形成的线性、分支以及环状的化合物的惊人多样性是极为重要的。这种多样性可因N、O和H原子的参与而进一步扩大。2、生物分子是分级的(1)代谢物和大分子　　无机物分子→（同化）转变成代谢物（氨基酸、糖、核苷酸、脂肪酸和甘油）→（通过共价）键构成大分子(蛋白质、多糖、DNA和RNA以及脂类)→（大分子间的相互作用导致）超分子复合物（酶复合物、核糖体、染色体和细胞骨架系统）（图1－2）(2)细胞器　　细胞器是生物分子等级中较高层次的一级。细胞器仅在真核生物细胞中发现。(3)膜　　膜是细胞和细胞器的边界（但将膜归为超分子装配体或者归为细胞器都不太适合，虽然它们具有两者共有的性质）。(4)细胞是生命的基本单位　　细胞是生命的单位，是唯一能展现生命特征（生长、代谢、刺激应答和复制）的最小实体。细胞可分为两种类型，即真核生物细胞和原核生物细胞。真核生物细胞具有复杂的内部结构。三、生物分子的特性反映它们对生命状态的适应1、生物大分子和它们的构件具有方向性　　生物大分子是由单位元件构筑而成的。蛋白质由氨基酸构成，核酸由核苷酸构成，多糖由单糖构成。这些构件分子是有极性的，即它们是不对称的。因此，从某种意义上说,它们是有“头”和有“尾”的。当这些构件分子组成生物大分子时，它们头-尾连结。于是，生物大分子聚合体也将是有头有尾的。因此，它们的结构应该是有“感应”（sense）的或者说是有方向的（图1－3）。2、生物大分子是信息分子　由于生物大分子对它们的结构及其组成元件具有感应，因此，只要构件单位的多样性或次序不是过分筒单或重复，它们的线性顺序就应含有特定信息的潜在能力。蛋白质和核酸的构件单位是以非显著重复方式排列的，它们的顺序是独特的。当把组成它们的构件单位以字母排列时，可以组成有意义的词语，然而并非所有生物大分子都含有信息。多糖往往由相同的单糖单位一次又一次地重复排列构成。这类同聚多糖不可能含有什么信息。3、生物大分子具有特征性的三维结构任何一种分子结构都是独特的，并具有可区别的特有的性质。生物大分子，尤其是蛋白质，分子结构已经达到了其复杂性的极点。4、非共价作用力维持生物大分子的结构共价键把原子结合在一起形成分子，非共价作用力是分子内或分子间的原子之间的吸引。非共价作用力是弱的作用力，包括氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用。这些作用力一般介于4–30kJ·mol-1范围。5、结构互补性决定生物分子的相互作用结构互补性是生物分子间识别的手段。生命的复杂而高度组织化的型式取决于生物分子彼此识别和相互作用的能力。如果一种分子的结构与另一种分子的结构是互补的，例如某种酶与它的专一性底物分子，那么这两种分子之间的相互作用就能准确地实现。结构互补性的原理是生物分子识别的基本要素.6、生物分子的的识别是由弱的相互作用力介导的通过结构互补性所发生的生物分子识别事件是由前面所述的弱的非共价键作用力介导的。7、弱的作用力把生物限制在一个窄范围环境条件中生物大分子仅在窄的环境条件下(例如温度、离子强度以及酸-碱度等)才有功能上的活性。极端条件将破坏维持大分子复杂结构所必需的弱的作用力。这些复杂大分子的有序结构的丧失(也就是变性)伴随着功能的消失。Section2水在生物化学中，水存在的意义是显而易见的：①几乎所有生物分子随环境中水的物理和化学性质而呈现它们的形态。②大多数生物化学反应的介质是水,代谢反应的反应物和产物在细胞范围内和细胞间运输都依赖于水。③水本身活跃地参与支撑许多化学反应，水的离子化组分(H＋和OH－)往往作为真正的反应物参与反应。事实上，生物分子的许多功能基团的反应性取决于环境介质中的H＋和OH－的相对浓度。④水的氧化产生的分子氧(O2)是通过光合作用完成的。⑤水的离子化产物(H＋和OH－)是蛋白质、核酸以及膜的结构与功能的关键决定者。⑥在膜的内外两侧的氢离子浓度的差异代表了能量转化的生物学机制所必需的能化状态。一、水的结构单个水分子的两个氢原子共价地与氧原子结合，呈现一种非线性排列（图1－4a,b）。水的氢键形成具有协同的性质。这就是说，作为受体的氢键结合的水分子是一种比未键合的水分子更好的氢键供体。（同样，作为氢键供体的氢键结合的水分子也是一种更好的氢键受体）。因此，水分子之间氢键的形成有一种彼此支援的现象。1、冰的结构在普通的冰中（它是水的一般晶体形式），每个水分子都有四个以氢键结合的最邻近者(图1－5)在冰结构中，每个氢原子都与邻近的水分子的氧原子形成氢键，而氧原子作为氢键的受体能与来自两个不同水分子的氢原子形成氢键。2、液态水的结构由于液态水的每个分子约10－12秒重新定位一次，因此很少有实验技术能探测这些水分子的瞬间排列。在液态水中，分子间的这些氢键已变形。结果使连接分子的氢键网是无规则的和可变的；而且，这样的氢键网是不断地被打断和重新形成，因而液态水是由快速波动的三维网状的氢键结合的H2O分子构成(图1－6a)。二、水的溶剂特性溶解度取决于溶质分子与溶剂分子之间的相互作用力以及溶质分子之间的相互作用力。由于水具有高极性，因而使得它对于极性物质和离子物质是一种极好的溶剂(1-6b)。 三、疏水相互作用非极性物质（或者生物大分子的非极性功能基团）不易与水形成氢键。因此，这类化合物只能在水中极少溶解。当非极性物质或基团侵入液态水时，将会破坏原有液态水分子之间的氢键网，溶质周围的水发生大的重新排列。为了重新获得它们失去的氢键能，表面的水分子指向它们自身，以四面体氢键的方式形成一种封闭的、类似笼子的氢键网（图1-7）。环绕非极性溶质的水分子的有序化产生了不利于非极性溶质水化的自由能.因此非极性溶质趋向于从水相中排出。当非极性溶质彼此相遇而聚集时，它们所占据的空间的表面积小于它们各自单独占有空间的表面积之和。因此，非极性溶质的聚集能够减小所占空间的表面积，随之导致非极性溶质表面的水的有序化程度总量降低。换句话说，非极性溶质相互吸引、避开水的倾向是水分子有序度的减少（或者说混乱度增加）所产生的熵增所推动的。熵是一个系统有序程度的一种量度。任何系统的有序度的减少或者混乱度的增高都会伴随熵的增加。四、中极两性分子含有极性基团和非极性基团的化合物称为中级两性化合物（amphiphiles）。这类化合物既有亲水性又有疏水性。（图1－8）。因此，当中性两性化合物分子与水溶剂相互作用时，中极两性化合物趋向形成结构上有序的排列。胶束（或微团）（micelle）是由数千种中极两性化合物构成的小球（图1－9中极两性分子在水溶液中形成胶团.）。中极两性分子也能形成另一种有序的结构形式---双分子层结构，与生物膜的结构相似。因此，中极两性化合物的这种特殊的性质是生物膜构成的基础。 五、溶质对水的性质的影响▲溶解物质的存在打乱了液态水的结构,使水的性质发生改变。生物机体内部的水与纯水很不相同。细胞内部和细胞周围的液体是被各种溶质充塞的，这些溶质包括从很小的无机离子到巨大的分子聚集体。▲溶质的浓度影响水的依数性（colligativeproperties）。依数性是溶液的一种物理性质，它取决于溶质的浓度而不是溶质的化学特性。例如，溶质的存在能降低水的冰点和升高水的沸点，因为溶质的存在使水分子更难以结成冰，也更难以从溶液逃溢出变成气态。▲渗透压也与溶质的浓度有关。当溶质与纯水被一层只允许水分子通过而不允许溶质通过的半透膜分开时，水移动进入到溶液中，以便使膜两侧的浓度趋于平衡。渗透（Osmosis）是溶剂从高浓度区（这里是纯水）向相对低的浓度区（含溶质的水）的移动。溶液的渗透压（Osmosispressure）是必需施加给溶液以阻止水向内流动的压力（图1－10）。这种压力与溶质的浓度成正比。▲当水溶液被一层允许水和溶质渗透的膜隔开时，水可以向内运动，溶质也可以从溶液中向外运动，直到膜两侧的溶质浓度达到相同为止。分子的这种随机运动叫做扩散（diffuse）。当平衡确立时，没有水和溶质的进一步净流动，虽然分子继续在运动。六、水的离子化和pH水是一种中性分子，只是具有很弱的离子化倾向。人们通常用下面的式子表达水的离子化：H2O←→H＋＋OH—实际上，自由的H＋是不存在的，而是与水分子结合，以水合氢离子（H3O＋）的形式存在。质子可与一簇水分子结合形成具有H5O2＋、H7O3＋等等分子式的结构。为了简便，可以把这些离子形式合并以H＋代表。水合氢离子的质子可以很快地一个水分子跳跃到另一个水分子（图1-11）。氢键网为H＋的快速迁移提供了一条天然的路线。质子经氢键网快速迁移的质子跳跃（protonjumping）为生物学上许多重要的质子转移（例如快速的酸-碱反应）提供了解释。根据水的离子化及其平衡常数，可以推导表达水溶液氢离子浓度的方程式：pH＝log(1/[H＋])＝–log[H＋]由于纯水的[H＋]＝10-7mol·L-1，因此，用pH来描述纯水的氢离子浓度即为：pH＝log(1/1×10-7)＝log(1×107)＝log1.0＋log107＝0＋7.0＝7.0pH值越高，H＋浓度就越低；pH值越低，H＋浓度就越高。 七、酸-碱化学由水解离产生的H＋和OH－是生物化学反应的基础。生物分子，例如蛋白质和核酸，具有众多的可作为酸或碱的功能基团（例如羧基和氨基）。这些分子影响液态介质的pH，它们的结构和反应性也会受到周围pH的影响。因而正确评价酸-碱化学是了解许多分子的生物学作用所必须的。1、酸是质子的供体按照J.Brønsted和T.Lowry关于酸和碱的概念，凡是能供出质子的物质即是酸，凡是能接受质子的物质即为碱。按照这一定义，碱-酸反应可以表述为：HA＋H20→H3O＋＋A－酸（HA）与碱（H2O）反应，形成酸的共轭碱（A－）和碱的共轭酸（H3O＋）。相应地，醋酸离子（CH3COO－）是醋酸（CH3COOH）的共轭碱，铵离子（NH4＋）是氨（NH3）的共轭酸。牵涉到水参与的酸-碱反应，往往可以缩写为HA←→H＋＋A－2、酸的强度可用它的解离常数来表示酸-碱反应的平衡常数用反应物和产物的解离常数来表达：K＝[H3O＋][A－]/[HA][H2O](1)(在稀溶液中,水的浓度基本上是恒定的常数（1000g·L-1/18.015g·mol-1＝55.8mol·L-1）。因此，[H2O]项通常与解离常数合并，即：Ka＝K[H2O]＝[H＋][A－]/[HA](2)由于酸解离常数象[H＋]值一样使用起来不方便，因此可用公式将其转换成的pKa值(为了使用的方便,将下标a省去):pK＝－logK(3)3、溶液的pH由酸和碱相对浓度决定一种溶液的pH和酸以及它的共轭碱之间的相互关系可以很容易推导出来。将方程（2）重排[H＋]＝K([HA]/[A－])(4)两边取负对数：－log[H]＝－logK＋log([A－]/[HA])从而得到：pH＝pK＋log([A－]/[HA])(5)这种关系式称为Henderson-Haselbalch方程。当某种酸[HA]和它的共轭碱[A－]的浓度相等时，log([A－]/[HA])＝0，溶液的pH在数值上相当于酸的pK值。Henderson-Hasselbalch方程对于计算含有已知浓度的弱酸和它的共轭碱的溶液的pH来说是非常有用的。八、缓冲系统弱酸（例如醋酸）在水中只能部分离子化，它所释放出来的H＋是可以被滴定的。当用已知浓度的碱（通常使用NaOH）滴定醋酸溶液时，获得如图1－12所示的滴定曲线。当滴定开始时，HAc大部分以未离子化的形式以HAc存在，同时也有一定量的H＋和Ac－存在。NaOH溶液的加入允许氢氧离子（OH－）中和存在的H＋。当H＋被中和时，更多的HAc解离成H＋和Ac－.当进一步加入NaOH时,pH随Ac－的积累而逐渐升高。当处在HAc的一半被中和时的位点，已加入等当量的NaOH。此时溶液中的HAc和Ac－相等，pH＝pK.因此，人们可以用实验方法测定弱电解质的pK值。弱电解质的pK往往位于滴定曲线的中点。但是，滴定中点的pK值则随不同性质的电解质而不同。如醋酸的pK为4.7、咪唑的pK为6.99、NH4＋的pK为9.25。pK值直接与这类物质的解离常数有关，或者说与共轭碱对H＋的亲和力有关。pH的维持对所有细胞都是至关重要的。细胞过程（例如代谢）取决于酶的活性，而酶的活性又显著地受pH的影响。因此，pH的改变会极大地对代谢反应造成破坏。生物有各种保持它们细胞内和细胞外液体pH基本恒定的机制，但是阻止有害pH变化的最重要的机制由缓冲系统提供。所选择的缓冲系统反映了对接近pH7的pK值以及缓冲剂组成与细胞代谢机构的一致性两方面的需要。磷酸盐系统（HPO4²¯/H2PO4¯）和碳酸盐系统（HCO3¯/H2CO3）是生物体内的两种重要的缓冲系统。前者主要维持细胞内pH的恒定，而后者在维持细胞外液的pH稳定中起作用。此外，许多生物分子，例如蛋白质以及小分子的有机物，由于含有多个酸-碱基团，它们在生理pH范围内都是有效的缓冲系统的组分。Chapter2蛋白质(Protein)Section1蛋白质概述一.   蛋白质是生物体内的最重要的物质①蛋白质约占细胞干重的50%以上。②蛋白质与核酸共同构成了生命现象的物质基础，是细胞原生质的主要成分。③催化生物体内几乎所有化学反应的酶是蛋白质。④抵抗外源性异物侵害而产生免疫反应的抗体是蛋白质。⑤调节物质代谢的许多激素也是蛋白质或多肽。⑥肌肉收缩、物质的运输、结缔保护、病毒对宿主的感染等都是蛋白质在起作用。⑦胚胎发育、生长、分化和繁殖等都有蛋白质参与。 二、蛋白质的元素组成蛋白质主要含有C、H、O、N以及S元素。N元素是蛋白质的特征性元素，根据对大多数蛋白质的N元素分析，其含量相近，一般在15—17%，平均为16%。三、蛋白质的基本组成单位是氨基酸经水解分析，构成氨基酸的蛋白质约20种，这些氨基酸借肽键聚合成蛋白质。 四、蛋白质是基因编码的直接参与蛋白质合成的氨基酸在遗传上都存在相应的密码，这些密码子存在于基因的核苷酸顺序中，分子生物学研究表明，基因的核苷酸顺序通过转录拷贝到mRNA上，mRNA的编码信息，即三联密码子直接决定着蛋白质多肽的氨基酸顺序。Section2氨基酸(Aminoacids)一.氨基酸的结构通式除脯氨酸外，其它所有氨基酸在结构上都有一个共同的特点，即在与羧基相连的α-碳原子上含有一个氨基（图2-1）。从这个结构通式可以看出，氨基酸的差别就表现在侧链R基团上。 二.氨基酸的结构和分类：根据氨基酸側链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。1.非极性R基氨基酸（共9种）（图2-2）：甘氨酸(Glycine,Gly,G),丙氨酸(Alanine,Ala,A),缬氨酸(Valine,Val,V)),亮氨酸(Leucine,Leu,L),异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),脯氨酸(Proline,Pro,P),苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸(Methionine,Met,M)2.无电荷的极性R基氨基酸（共6种）（图2-3）：丝氨酸(Serine,Ser,S),苏氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q) 3.带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）（图2-4）：赖氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),组氨酸(Histidine,His,H) 4.带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E) 三．氨基酸的构型：氨基酸的构型是以D-、L-甘油醛为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 确定的。除甘氨酸外，其他所有α-氨基酸都是L-型的（图2-5）。四、紫外吸收特性：酪氨酸和色氨酸在280nm处具紫外吸收特性，蛋白质通常含有这样的氨基酸，故可以在280nm处测定蛋白质的含量,并利用下式计算蛋白质的含量。C＝A/εL五、氨基酸的酸碱性质1.氨基酸的两性解离性质氨基酸在水溶液中或在晶体状态下主要以两性离子形式在.作为酸：R-CH-COO-—→R-CH-COO-＋H＋||NH＋3NH2 作为碱：R-CH-COO-＋H＋—→R-CH-COOH||NH＋3NH＋3氨基酸在不同的pH条件下可解离成带不同的电荷：COOHCOO-COO-|＋H＋|–H＋|H＋3N―C―H←→H＋3N―C―H←→H2N―C―H|-H＋|+H＋|HHH酸性状态(A)两性离子状态(Z)碱性状态(B) 2.氨基酸可解离基团的pK值与等电点（pI）的关系：对于中性氨基酸：pI=(pKa1+pKa2)1/2对于酸性氨基酸：pI=(pKa1+pKaR)1/2对于碱性氨基酸：pI=(pKa2+pKaR)1/2这种关系可通过酸碱滴定曲线来确定（图2-6）。从滴定曲线可看出，每种氨基酸是在它的pKa值附近而不是在它的pI处发挥其缓冲作用。在等电状态，氨基酸净电荷为零，且解离成阳离子和阴离子的数目和趋势相等。图2-7和图2-8分别是酸性氨基酸和碱性氨基酸的酸碱滴定曲线。六．氨基酸的电泳分离和离子交换：1.氨基酸的电泳分离电泳(Electrophoresis)是指带电质点在电场中的移动（图2-9）。如果带电质点在恒定电压和恒定粘度的介质中泳动，带电质点的迁移率(µ)可用下式表示：µ∝Q/r如果它们在大小方面也没有明显的的差别，带电质点的迁移率可用下式表示：µ∝Q各氨基酸所带净电的差异（Q）可用pI-pH表示。 2.离子交换层析是分离分析氨基酸的有效方法离子交换剂共价地结合许多可解离为阴离子或阳离子的基团，可以与周围溶液中的其它相反离子或离子化合物结合（图2-10）。当把被分离的氨基酸混合物的溶液调至pH3.0时,氨基酸都带净正电荷。但由于每种氨基酸的电离状态不同，因而它们的净正电荷的程度也不同，故被洗脱下来的速度也不相同。除了电荷作为主要分离因素外，氨基酸侧链与树脂的非极性骨架之间的相互作用也是影响分离的因素。现在常用高效液相层析(HPLC)代替普通的离子交换层析。 七、氨基酸的化学反应1.与亚硝酸反应：R－CH－COOH+HNO2—→R－CH－COOH+N2↑+H2O‌｜NH2OH只要测定释放的N2体积，便可计算出氨基酸的含量，这是VanSlyke(范氏)氨基氮测定方法的基础。2.与甲醛的反应3.与二硝基氟苯的反应4.与苯异硫氰酸的反应5.与二甲氨基萘-1-磺酰氯（DNS-Cl）的反应6.成酯和成盐反应7.与茚三酮的反应Section3肽一．肽、肽链和肽键氨基酸与氨基酸之间可以通过α-氨基和α-羧基形成的酰胺键共价地结合在一起,这样形成的产物叫做肽（Peptide）。在蛋白质化学中，这种酰胺键称为肽键（Peptidebond）（图2-11）。由氨基酸借肽键所形成的一条线性的链状分子就叫做肽链(peptidechain)。在肽链结构中,每个的氨基酸不再是完整的，因此叫做氨基酸残基（residue）。蛋白质是由单一肽链或多条肽链构成的大分子。这些多肽链在长度上一般超过40个以上的氨基酸残基，最大者甚至超过4000个氨基酸残基。若按氨基酸残基平均分子量110计，则蛋白质分子量范围大约是4000-440000Da(4-440kD)。除某些特殊的环状小肽外，寡肽和多肽都是线性分子，仍然保留一个未反应的氨基末端（N-末端）和一个羧基末端（C-末端）。在某些蛋白质中，N-末端往往被甲酰基或乙酰基封闭；也有些蛋白质的C-末端被修饰成酰胺。一条多肽链的模式结构如下所示（图2-12）。从该模式结构可以看出，每种多肽或蛋白质都有相同的主链（backbone）,而每种多肽或蛋白质之间的差别则表现在多肽链中的氨基酸残基顺序的不同。 二．肽的性质1．肽键可被水解2．肽的解离性质肽是一类多聚两性电解质，随环境pH的变化，可以电离成带正电荷、负电荷或者净电荷为零等不同的状态。每一种多肽都有它的等电点，可通过酸碱滴定曲线来确定。等电点的差别反映出它们的氨基酸组成不同和侧链可电离基团的种类和性质的差别。三．生物活性肽几乎所有生物体内部都存在多种非蛋白质肽。这类物质都有相应的生物活性，尽管人们并不完全清楚它们的功能。通常我们把这些肽类统称为生物活性肽。生物活性肽在组成、结构和大小方面存在很大的差异。有的呈环形，有的有分支，有的还含有D-氨基酸和氨基酸类似物（图2-13）。 四．蛋白质的结构水平可分为：一级、二级、三级、四级结构。Section4蛋白质的一级结构和测定蛋白质的一级结构测定是指蛋白质分子中氨基酸排列顺序的测定。有二条途径：一条是直接测定多肽链的氨基酸顺序；另一条是间接的，即从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。一．直接法：①获得高纯度的单一蛋白样品，测定其分子大小。②确定肽链的数目(末端分析)；③氨基酸的组成分析；④拆开二硫键；⑤部分水解；⑥片段的氨基酸顺序测定；⑦片段重叠，拚出完整肽链的氨基酸顺序；⑧确定二硫键和酰胺基的位置。1.氨基酸的组成分析蛋白质在标准条件下经酸水解后,进行氨基酸的组成分析.通过组成分析基本上可推测出部分水解所产生的肽碎片的数目。2．末端分析(确定蛋白质的肽链组成)：通常测定肽链的N-末端.二硝基氟苯(DNFB)法或丹磺酰氯（DNS-Cl）法是常用的方法。丹磺酰氯（图2-14）为一种更有效的试剂，灵敏度比DNFB法高100倍。1.拆开链间或链内的二硫键1).还原法：用巯基乙醇(HSCH2CH2OH)或二硫苏糖醇等还原性试剂使二硫键打开，还原生成-SH（图2-15）2).氧化法：常用过甲酸(CHOOOH)作为氧化剂，使二硫键氧生成半胱氨磺酸(磺基丙氨酸残基)（图2-15）。2.肽链的部分水解常用胰蛋白酶法,胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法（2-16）。下面是一个典型的多肽，用胰蛋白酶(糜酶)、胰凝乳蛋白酶和溴化氰分别处理所得到的结果：↓↓↓↓↓↓Ala—Arg—Arg—Met—Phe—Ala—Lys—Asp--Phe--Leu--Lys 用胰酶处理：用糜酶处理：用溴化氰处理：Ala-ArgAla-Arg-Arg-Met-PheAla-Arg-Arg-MetArgAla-Lys-Asp-PhePhe-Ala-Lys-Asp-Phe-LysAsp-Phe-Leu-LysLeu-LysMet-Phe-Ala-Lys5．肽碎片的氨基酸顺序分析：Edman降解法（图2-17）：专用试剂是苯异硫氰酸。羧肽酶法：羧肽酶A：从C-末端依次降解末端残基，含芳香环的或脂肪烃基较大的残基易被水解。但该酶不能水解C-末端的Arg、Lys和Pro。羧肽酶B能专门水解C-末端的Arg和Lys，对其它残基不起作用。如果C-末端第二个残基是Pro，则酶A和酶B都不起作用。羧肽酶C能水解C-末端的Pro. 6.片断重叠确定整个肽链的氨基酸顺序：胰酶：Ala-ArgArgMet-Phe--Ala-LysAsp-Phe--Leu-Lys糜酶：Ala-Arg—Arg--Met-PheAla-Lys—Asp-PheLeu-Lys------------------------------------------------------全顺序Ala-Arg—Arg--Met-Phe--Ala-Lys—Asp-Phe--Leu-Lys六．蛋白质一级结构测定的生物学意义： 1.蛋白质一级结构的种属差异同源蛋白质(homologousproteins)以胰岛素和细胞色素c为例说明。图2-18示出了细胞色素c种系发生树。2.蛋白质一级结构的个体差异以血红蛋白(Hemoglobin)为例。HbA:H3＋N－Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys－COO－HbS:H3＋N－Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Val-Lys－COO－Section4蛋白质空间结构一.蛋白质空间构象的概念及研究方法蛋白质空间构象是指蛋白质多肽链主链在空间上的走向及所有原子和基团在空间中的排列与分布。蛋白质的空间结构包括二级结构、三级结构和四级结构。◆X-射线晶体衍射和核磁共振光谱是研究大分子结构的主要方法。X-射线晶体衍射可用来研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构,核磁共振(NMR)光谱可用来研究处在溶液状态的蛋白质的结构。二.蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链主链在空间中的走向。一般呈有规律的空间折叠。不涉及侧链基因的构象。1.多肽链的构象可用肽基间的拉角来描述肽键上的亚氨基、羰基和两端的两个Cα构成了一个肽平面(或肽基或酰胺平面)（图2-19），肽键上的C-N键具有部分双键的性质，只有有限的旋转，因而使一条肽链因肽键旋转所造成的构象数目受到限制。但位于肽基两侧的Cα与氮原子间的连接键是纯粹的单键，Cα与羰基碳原子间的连接键也是纯粹的单键。这两个单键在刚性平面的任何一侧都有较大的旋转程度。Cα--N单键旋转的角度用Φ表示，Cα--C单键旋转的角度用ψ表示。但这两个单键的旋转也受到主链的酰胺氢和羰基氧的障碍和α-碳原子上的侧链基团的大小和性质的限制。由于Cα实际上处于两个刚性平面的交线上，所以由Cα参与形成的两个扭角(φ和ψ)决定了相邻两个肽基的相对位置。多肽链主链的构象可用每α-碳原子的一对扭角来描述。实验表明，肽链中所有肽基基本上都有相同的键距和键角，每个α-碳原子都是一个正四面体结构。因此，多肽链主链的构象是由肽基上与每个Cα相连的两个单键的旋转所成的Φ角和ψ角决定的。在多肽链中，任何一对扭角如发生变化，多肽链主链的构象必然发生相应的变化，如果所有与Cα相连的这一对扭角都分别相等，则多肽链主链呈现为有规律现象。当多肽链处在完全伸展状态时，Φ角和ψ角规定为180°（图2-20）。2.α-螺旋结构是有规律的主链结构α-螺旋(α-helix)是一种常见和稳定的螺旋结构（图2-21）。由于与每个α-碳原子相连的一对扭角在α-螺旋(α-helix)结构中都分别相等(Φ＝-57°,ψ＝-47°)，因此，α-螺旋是多肽链主链的一种有规律的构象，是蛋白质分子中的普遍存在的一种典型的二级结构要素。在α-螺旋中，主链氢键是稳定该结构的主要因素（图2-21）。氢键是蛋白质二级结构稳定的作用力。氢键是在多肽链中第n个残基的羰基氧与螺旋方向的第n＋4个残基的酰胺氢之间形成的（图2-22）。α-螺旋的提出，首先较好地解释了存在于毛发中的α-角蛋白(α-keratin)的结构特征（图2-23）。α-螺旋构象不仅存在于象α-角蛋白这样的纤维蛋白质中，而且在球状蛋白质分子中也广泛存在。 3.β-折叠片也是一种有规律的二级结构在蛋白质结构中,存在两种不同的β-片，即反平行的和平行的二种（图2-24）。由于在每种折叠形式中,每对扭角都是分别相等的,故这两种结构都是有规律的主链构象。在β-片中,氢键的形成出现在相邻肽链之间而不象α-螺旋那样出现在螺旋内。β-片由于有最适的氢键结合，与完全伸展的肽链构象不同，β-片呈波纹状（图2-25），故此名。丝心蛋白的X-射线晶体衍射分析表明，其空间结构与α-角蛋白完全不同，呈现为反平行的β-片状（图2-26a图2-26b）。在丝心蛋白的长轴方向上具有0.7nm的重复距离，所以丝心蛋白的空间结构是β-析叠式的。β-片在球状蛋白质分子中也广泛存在。4.β-转角和卷曲结构大多数蛋白质都是球状的。因此，多肽链必须具有弯曲、转角和自然改变方向的能力，以便产生紧凑的球状结构。在许多蛋白质中都可观察到一种称作β-转角(β-turnorβ–bend)的结构，它是由4个连续的氨基酸残基组成（图2-27）。有两种主要的β-转角，都是通过一个残基上的羰基氧与肽链下游的第三位残基上的酰胺氢之间形成氢键，以此稳定这种结构。由于β-转角的存在，就允许蛋白质弯曲并倒转它的肽链方向，脯氨酸和甘氨酸是频繁出现在β-转角中的残基。卷曲结构是一种难以描述的多肽链走向，也存在于球状蛋白质分子中。三、球状蛋白质和三级结构球状蛋白质近似球形。蛋白质的三级结构(tertiarystructure)和四级结构通常是针对球状蛋白质而言。蛋白质的三级结构是指蛋白质分子中的所有原子的三维空间排列，包括它们的二级结构要素(如α-螺旋和β-片)和它们的侧链在空间上的相互关系。 1.三级结构的某些特征：1).球状蛋白质常都含有α-螺旋和β-折叠片两种基本要素（图2-28）2).侧链的定位随极性而变化3).超二级结构(supersecondarystructure)即基元(motif)在许多蛋白质分子中常观察到二级结构要素的某些组合，即超二级结构或称为基元。这些组合有：●βαβ基元：两个平行的β链由一个α-螺旋右手交联,为最常见的一种组合（图2-29）。●β-发夹基元：由三条反平行的β链(或肽段)组成。●αα基元：由二条连续的反平行的α-螺旋构成。●β-桶式(β-barrel)基元：由连续的β-片卷筑而成(有三种不同的形式)。4).结构域(domain)分子较大的多肽链常折叠成两个或多个球状簇，这种球状簇叫做域或结构域。大多数域由100--200个氨基酸残基构成。平均直径约2.5nm。结构域常具特殊功能，例如，结合小分子(3-磷酸甘油醛脱氢酶同NAD的结合属于这种情况)（图2-30）。 2.  蛋白质空间构象稳定的因素蛋白质多肽链在生理条件下折叠形成特定的空间构象显然是热力学上一种有利的过程，是各种作用力相互作用、精巧平衡的结果。▲离子相互作用：蛋白质分子的相反电荷基团的结合称为盐键或离子键(离子对)（图2-31）。▲氢键:氢键是一种由弱酸性的供体基团(D-H)和一个具独电子的原子(A)之间形成的最显著的静电作用力。蛋白质具有众多的氢键供体和受体，包括主链上的羰基和酰胺基及极性侧链基团。▲偶极与偶极间的相互作用:在电中性分子之间的非共价结合统称为范德华力。这种力产生于永久的或诱导的偶极之间的静电相互作用。偶极与偶极间的相互作用包括永久偶极间的相互作用、永久偶极与诱导偶极间的作用和瞬时偶极间的作用（图2-32）。▲疏水作用:疏水作用是由于蛋白质多肽链的疏水残基具有避开水的倾向、彼此在分子内聚集所产生的作用力（图2-33）。这种力是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。▲二硫键:二硫键是某些蛋白质维持结构稳定性的主要因素，由两个Cys的侧链-SH氧化而成（图2-31）。四、寡聚蛋白质(oligomericprotein)和四级结构1.四级结构研究的内容：生物体内的许多蛋白质都含有两个或多个折叠的多肽链，它们彼此聚集，构成一个完整的、有功能的实体，这种蛋白质称寡聚蛋白质。在寡聚蛋白质中，每一条折叠的多肽链称为亚基(subunit),亚基可相同也可不同，取决于寡聚蛋白质的亚基组成。由于寡聚蛋白质是由多个亚基组成，每个亚基有其本身的折叠结构(三级结构)，所以研究寡聚蛋白质中亚基的数目和亚基间的相互关系(即它们的空间位置)就构成了寡聚蛋白质四级结构的内容。在寡聚蛋白质中，稳定亚基间相互关系的作用力与维持蛋白质三级结构的作用力相同，即亚基间的离子键、氢键和疏水作用力。在研究寡聚体蛋白质的结构中，有时使用原体(protomer)这一名称。原体可由一条肽链(一个亚基)构成,也可以由几条不同的肽链(几个不同的亚基)构成.例如血红蛋白是由二个α-亚基和二个β-亚基构成的四聚体(α2β2)。在血红蛋白中，一个α-亚基和一个β-亚基组合成一个原体。在这个意义上说，血红蛋白是由二个原体构成的一种二聚体。2.寡聚体蛋白质亚基的对称性：在寡聚体蛋白质中，虽然每个亚基本身是不对称的，但是，整个寡聚体的四级结构却是对称的，即原体(或亚基)在几何学上占据寡聚体对等的位置。但是，蛋白质不可能倒置或镜像对称，因为这样一种对称结合把手性L-残基转变成D-残基。因此，蛋白质只有旋转对称(rotationalsymmetry)这样一种类型的对称方式（图2-34）。3.亚基组成测定4.寡聚体蛋白质存在的意义☆增高蛋白质的稳定性.亚基结合的一个普遍性的好处是有利于减少蛋白质表面积/体积比。表面积/体积比越小，那么一个物体的半径就越大。因为对于球形物体来说，表面积是半径平方的函数，体积是半径立方的函数：表面积＝4πr2；体积＝4/3πr3；表面积/体积＝3/r.由于在一个蛋白质范围内的相互作用通常在能量上是有利于蛋白质的稳定,由于蛋白质表面与溶剂水的相互作用往往在能量上是不利的，因此在通常的情况下，减少表面积/体积的比例将会使蛋白质变得更加稳定。☆遗传上的经济性和有效性.蛋白质单体的寡聚结合对一种生物来说，在遗传上是经济的。编码一个能装配成同聚多体的单体所需要的DNA片段比编码一条与该同聚多肽具同样分子量的大多肽所需的DNA片段小许多。实际上，决定寡聚体的装配以及亚基-亚基的相互作用的全部信息都包含在编码单体所需的遗传物质中。例如HIV(人类免疫缺陷性病毒)蛋白酶是由相同亚基构成的一种二聚体蛋白质，它履行与同源细胞的酶相似的功能(即都能催化蛋白质的水解)，但是HIV蛋白酶的分子量只是那些由单一肽链构成的酶的一半。☆协同性.这是寡聚体蛋白(包括寡聚体酶)的一个重要的性质。这方面的相关例子在后续有关章节中将会涉及到。☆汇聚酶的活性部位.许多酶的催化效力来自单个亚基的寡聚结合。单体也许不能构成完整的活性部位，寡聚体的形成可能使所有必需的催化基团汇聚形成酶的活性部位。例如，细菌谷氨酰胺合成酶的活性部位就是由相邻亚基对构成的，解离的单体是无活性的。☆寡聚体酶的不同亚基也许执行不同但相关连的反应。例如色氨酸合酶是一种由两种亚基构成的四聚体蛋白(α2β2)，纯粹的α-亚基催化下面的反应：吲哚甘油磷酸←→吲哚＋甘油醛-3-磷酸而纯粹的β-亚基催化的反应是:吲哚＋L-丝氨酸←→L-色氨酸吲哚既是α-亚基的产物，又是β-亚基的底物，它直接从α-亚基进入到β-亚基，当它作为一个游离的中间物时，是不可能检测到的。 五、蛋白质的变性(denaturation)天然蛋白质在构象上的亚稳定性的，很容易受到许多不利因素的影响而破坏其结构。当蛋白质加热变性时，其构象上的敏感特征如比旋度、粘度和紫外吸收等在一个很窄的温度范围内急剧变化。表明蛋白质的结构只要有任何局部的破坏，都将导致整个结构的瓦解。蛋白质的变性只破坏其空间结构而不破坏它的一级结构；蛋白质的变性包括从有序到无序的转变。六．蛋白质的氨基酸顺序与空间构象的关系决定蛋白质三维构象的信息存在于它们的特定的氨基酸顺序中。 1.蛋白质的复性实验：Anfinsen证明，变性的核糖核酸酶A（RNaseA）只有处在天然构象稳定的条件下才能重新形成它的正确的二硫键，并恢复酶的活性。只有当酶重新把-SH安置在正确的配对位置才能予以解释（图2-35）。表明二硫键不是正确折叠所必需的。该实验证明了蛋白质的特定的空间构象是由它的一级结构即氨基酸顺序决定的。 2.蛋白质折叠途径局部折叠的二级结构—→熔融小球—→三级结构形成开始—→具域结构的三级结构形成（图2-36）。 3.氨基酸的性质、顺序与空间构象的关系Leu、Met、Glu、Ala是α-螺旋的强形成者；Ieu、Val、Phe、Tyr是β-螺旋的强形成者；Pro、Gly是α-螺旋的强破坏者；Pro也不适合于β-片。Pro、Gly往往出现在β-拐角处，而Val则不会出现。此外在Cβ位有分枝的残基(例如Ile,Thr)连续出现则使α-螺旋失去稳定（表2-1）。Section5蛋白质结构与功能的关系一、血红蛋白与肌红蛋白的功能比较血红蛋白是血液中红细胞的主要蛋白质。主要功能是通过动脉和静脉循环着的血液在肺部和毛细血管间转运氧。肌红蛋白存在于肌肉等组织中，当氧从毛细血管中扩散进入肌肉组织后，就被组织细胞内的肌红蛋白结合。肌红蛋白是组织细胞内的氧贮存者。氧的饱和百分数：Y=[HbO2／（HbO2+Hb）]×100％分压：混合气体中，各气体单独在同样的温度下占据混合气体的体积时所具有的压力。血红蛋白和肌红蛋白对氧亲和力的差别导致一种有效的氧释放系统的产生，该差别是由它们的分子结构不同所致。二、血红蛋白的结构与功能的关系肌红蛋白是由153个aa残基组成的单链蛋白，整个分子被包装成一个紧密的实体(图2-37)。含有一个血红素(heme)辅基，它被包埋于E-螺旋和F-螺旋的孔穴内。血红素是含铁的原卟啉。卟啉环结合的Fe在正常下保持亚铁离子状态。铁离子可形成六个配位键，其中一个与O2结合（图2-38）。血红蛋白的α-亚基和β-亚基在结构和进化上彼此相关，也与肌红蛋白相关。α-亚基由141个氨基酸残基组成，β-亚基由146个氨基酸残基组成。这两个亚基在一级结构上与肌红蛋白具有部分顺序同源性。血红蛋白的两个αβ原体呈双重旋转对称（图2-39）。 1．两者的氧合曲线是不同的：肌红蛋白的氧合曲线是双曲线，而血红蛋白的氧合曲线是S型曲线（图2-40）。S形的结合曲线是一种蛋白质的小分子结合部位之间协同作用的标志。这就是说，一个小分子的结合影响其余小分子的结合。血红蛋白是一种四聚体分子，每个亚基都能同O2分子结合。这与肌红蛋白分子只有一个氧结合部位不同。因此，很可能当一个亚基的氧结合部位同氧结合后就影响其他亚基对氧结合的亲和力。氧合作用对血红蛋白的四级结构产生广泛的影响，即氧合和脱氧血红蛋白有不同的结构形式。蛋白质在表达功能的过程中，其构象发生变化的现象叫做变构作用或别构作用(allostericefect)。别构作用是寡聚体蛋白质在行使功能时的一个共同的特征。血红蛋白与氧结合时的协同效应是别构作用的结果。 2．协同效应的机制◆Fe2＋移入到卟啉环平面内触发了T态向R态构象的转变（图2-41）◆T态由盐键和氢键网稳定，必须打断才能形成R态(图2-42)◆T→R的转换是由形成Fe-O2键的能量推动的。 Section6蛋白质的性质及其分离纯化▲蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑将增加获取足量蛋白质的难度。▲目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:⑴ 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 的选择；⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；⑶蛋白质初步提纯；⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；⑸目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。一、蛋白质是两性电解质根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋白质的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的基团。作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点(pI)，这与它所含的氨基酸种类和数量有关。所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都能在细胞内起一定的缓冲作用。 1.蛋白质的电泳分离凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用于蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性电泳和变性电泳。●非变性电泳：蛋白质样品未进行变性处理，凝胶中没加入变性剂，通过电泳分离的蛋白质仍具有生物活性（图2-43）。●变性电泳：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis,SDS-PAGE)，SDS是一种带负电荷的阴离子去垢剂，分子式：CH3-(CH2)10-CH2-OSO3－Na＋，它能使蛋白质变性、肽链伸展，并吸附在伸展的肽链上，吸附的量与链长成比例。这样，大小不同的肽链具有相同的电荷，可根据蛋白质多肽链的大小使其分离，常用来测定蛋白质亚基的大小和鉴定蛋白质的纯度（图2-44）。●等电聚焦是在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上发展起来的一种用于检测蛋白质的方法，它与SDS-PAGE结合构成的双向电泳技术可用于确定蛋白质的亚基组成及电荷异构体的分析（图2-45）。●电泳后的蛋白质检测：◎考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据考马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的分离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋白质的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对该蛋白质进行定量分析。◎活性染色是根据有活性的目标蛋白质特有的生物化学反应产生的有色物质或另外加入某种能与产物生成颜色的物质来进行检测的.活性染色可以从一个复杂的蛋白质样品中检测到目标蛋白出现的位置(图2-43).活性染色法在同工酶(例如酯酶同工酶、谷氨酸脱氢酶同工酶、谷氨酰胺合成酶同工酶等)的检测中非常有用。◎免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹(Westernblotting)是检测目标蛋白质的一项十分有效的方法。一种蛋白质(抗原)能与它产生的抗体专一地反应。在电泳之后,欲检测目标蛋白的存在,可以先将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上,然后用目标蛋白产生的抗体与之产生抗原-抗体反应,最后可用连接有碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第二抗体(通用抗体)与第一抗体反应,加入能与抗体共接的酶反应生成有色物质的生色液,即可十分可靠地检到的目标蛋白(图2-46)。2.蛋白质的离子交换柱层析分离用于蛋白质分离纯化的离子交换剂多为纤维素离子交换剂。蛋白质样品同离子交换纤维素的结合力取决于彼此相反电荷基团的静电吸引，这与溶液的pH有关，因pH决定离子交换剂与蛋白质的解离程度。盐类的存在可降低离子交换剂的离子基团和蛋白质相反电荷基团之间的静电吸引。故蛋白质混合物的洗脱分离可由改变洗脱液中的盐类的离子强度和pH来完成。同离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱上洗脱下来（图2-47）。弱酸性的阳离子交换剂一般适合于分离pI＞7.0的蛋白质。弱碱性的阴离子交换剂一般适合于分离pI＜7.0的蛋白质。二、蛋白质的胶体性质与盐析分离蛋白质在水中可形成一种稳定的亲水胶体。细胞原生质的主要成分是蛋白质，原生质的胶体状态主要是由蛋白质的胶体性质所造成的。盐溶现象：在盐溶液很稀的范围内，随着盐浓度的增加，球状蛋白质的溶解度也随之增加（图2-48），此现象称作盐溶(salting-in)。任何物质的溶解度都取决于溶质分子间的相对亲和力及溶质分子与溶剂分子的相对亲和力。任何降低溶质分子相互作用的因素以及加强溶质分子与溶剂分子相互作用的因素都有助于增加溶解度。盐析现象：随着盐浓度的继续升高，例如，达到饱和和半饱和的程度，蛋白质的溶解度逐渐变小，彼此之间相互凝聚而发生沉淀，此现象称作盐析(satting-out)。离子强度(μ)＝ΣCZn21/2 三、蛋白质的沉降作用及超离心分离沉降速度(ν=dx/dt)与蛋白质分子的大小和密度有关。沉降速度法，适用于分离沉降系数不同但密度相近的蛋白质。沉降平衡法，适用于沉降系数相近，但密度不同的蛋白质。沉降系数：当沉降界面以恒定的速度移动时，单位离心场里的沉降速度。凝胶过滤是指利用高度水化的，具有不同大小孔径的网状结构的惰性多聚物颗粒作为层析柱的填充物，把分子大小不同的蛋白质混合物上样到柱层析上，混合物中的各组分随着洗脱液的流动，按分子大小以不同的速度向下移动，从而把各组分分开（图2-49）。常用的有葡聚糖凝胶(sephadex,)或琼脂糖凝胶(sepharose)作为层析柱的填充物。五、蛋白质的配体特异性与亲和层析根据蛋白质的配体特异性，建立了一种非常有效的蛋白质分离方法——亲和层析法。假如某蛋白质A，在表现功能的过程中需要和B物质结合，且结合是特异的：A+B＝A·B假若用化学的方法先将B物质与一种不溶性载体(R)偶联，得到R-B，偶联到R上的B不丧失与A结合的能力的话，那麽，将含有A的混合蛋白通过装有R-B的层析柱时，A将与B结合,形成R－B·A，不能与B结合的杂蛋白将从柱下流出,然后用适当的洗脱液将A洗脱下来。练习题1.某种蛋白质当用凝胶过滤法测定其分子量为90kD，而用SDS-PAGE测定其分子量为60kD，无论是否有巯基乙醇存在都如此。为什么会有二种不同的结果？你认为哪种方法更准确？2.从下面的信息确定某一蛋白质亚基组成：1).用凝胶过滤法，测定其分子量为200kD，2).用SDS-PAGE，测定其分子量为100kD，3).在巯基乙醇存在下，用SDS-PAGE分析，获得的分子量为60kD和40kD.3.1).是Trp还是Gln更有可能出现在蛋白质的表面？2).是Ser还是Val更少可能出现在蛋白质的内部？3).是Leu还是Ile更少可能在α-Lelix的中间部位找到？4).是Cys还是Ser更有可能出现在β-Sheet中？4.在生理条件下，多聚赖氨酸呈随机卷曲的构象，在什么样的条件下，它可以形成α-helix？Chapter3.酶(Enzyme)Section1酶的基本性质一、酶是生物催化剂酶是生物细胞产生的、以蛋白质为主要成分的、能加快化学反应速度、使之迅速达到平衡、但不改变反应的平衡常数的生物催化剂。酶的催化活性受多种因素调节控制。二、酶能快细胞内的化学反应速度按照能量学的观点,一个化学反应并不是从反应物直接向产物生成的方向进行的。反应的发生,即产物的生成取决于过渡态或转换态(transitionstate)的能量状况。只有当反应物在空间定向上有利于反应以及反应物达到转换态所需的能量（即是否处在化学键的断裂或形成所需的范围内）时，反应才能发生。很显然,转换态越能有效的达到，反应的速度就越大。如图3—1所示,反应物从基态转变成转换态的能量差值称为活化能(△G‡)。毫无例外,每一种化学反应都有一个△G‡。根据转换态的理论，一种催化剂的作用在于以某种途径降低反应的活化能而增高化学反应速度。因此，在有催化剂存在的情况下，转换态能比较有效地达到，从而增高反应的速度。典型的酶促反应速度比无催化剂存在的反应要高出106～1012倍。 三、酶不能改变化学反应的平衡反应速度和反应平