芥菜开花调控蛋白AGL24与SOC1基因相互作用的分子机制

芥菜开花调控蛋白AGL24与SOC1基因相互作用的分子机制芥菜开花调控蛋白AGL24与SOC1基因相互作用的分子机制芥菜是我国南方广泛栽植的十字花科蔬菜作物,开花时间的早晚将会影响产品器官的产量与品质。虽然在模式植物拟南芥中已分离出大量与开花相关的基因,但是,在蔬菜作物芥菜上这些同源基因是否具有相似的功能,它们调控芥菜开花时间的分子机制究竟如何,目前并不清楚。迄今为止,有关芥菜AGL24蛋白与SOC1基因之间的作用机制仍未见报道。为了研究芥菜AGL24蛋白与SOC基因的互作机理,本试验通过酵母单杂交体系和双萤光素酶活性检测系统检测了芥菜SOC1启动子的全长、截短体（含CA...

芥菜开花调控蛋白AGL24与SOC1基因相互作用的分子机制芥菜是我国南方广泛栽植的十字花科蔬菜作物,开花时间的早晚将会影响产品器官的产量与品质。虽然在模式植物拟南芥中已分离出大量与开花相关的基因,但是,在蔬菜作物芥菜上这些同源基因是否具有相似的功能,它们调控芥菜开花时间的分子机制究竟如何,目前并不清楚。迄今为止,有关芥菜AGL24蛋白与SOC1基因之间的作用机制仍未见报道。为了研究芥菜AGL24蛋白与SOC基因的互作机理,本试验通过酵母单杂交体系和双萤光素酶活性检测系统检测了芥菜SOC1启动子的全长、截短体（含CArG-box基序的3个SOC1小片段）、突变体（CArG-box基序突变后的小片段）分别与AGL24蛋白之间的相互作用,从而筛选SOC1启动子与AGL24蛋白的结合区域。此外还利用农杆菌介导AGL24转化芥菜,从体内验证转基因植株对SOC基因表达及开花的影响。为深入研究SOC僮因的表达调控提供一定的理论基础。主要试验结果如下:1.芥菜AGL24基因的克隆及生物信息学分析以芥菜茎尖总RNA反转录cDNA第一链作为模板 ,扩增得到的AGL24基因的cDNA序列为666bp,预测编码221个氨基酸残基。通过ProtParam软件分析表明AGL24蛋白由20种氨基酸组成,其中Leu和Ser所占比例最高,相对分子质量为24.902kDa,理论等电点为7.672.芥菜SOC1启动子全长与AGL24蛋白相互作用检测筛选抑制重组酵母菌Y1H（pAbAi-SOC1生长的环酯肽抗生素（AureobasidinA,简称AbA）的最低浓度,结果表明当AbA浓度为100ng/mL时，酵母重组菌株Y1H（pAbAi-SOC1不能生长,由此说明抑制重组酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1的AbA最低浓度为100ng/mL。然后将构建好的酵母表达载体pGADT7-AGL2转化到Y1H（pAbAi-SOC1酵母感受态细胞中,发现二倍体酵母Y1H（S0C1+AGL2能在sd/-leu/aba100上正常生长,表明芥菜soc1启动子能与agl24蛋白相互作用。同时,构建双萤光素酶表达载体luc-soc1和sk-agl24,通过冷热刺激法转化到农杆菌gv3101(psoup)中。然后将这两种菌液按1:9的比例混合共侵染6片左右真叶的本氏烟,60h后在glomax?-multi+多功能检测仪上检测萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶的活性,并计算萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶的比值。结果表明，试验组的比值显著高于阴性对照组的，说明socl启动子与agl24蛋白在植物细胞内可以互作。3.芥菜socl启动子的截短体与agl24蛋白相互作用检测为了进一步找出agl24蛋白与soc1启动子结合的关键区域,本试验筛选出抑制重组酵母菌株y1h(pabai-soc1-1)、y1h(pabai-soc1-2)和y1h(pabai-soc1-3)生长的aba最低浓度分别为100ng/ml、150ng/ml和100ng/ml。然后将酵母重组质粒pgadt7-agl24分别转化到y1h(pabai-soc1-1)、y1h(pabai-soc1-2)和y1h(pabai-soc1-3)酵母感受态细胞中。结果发现:只有二倍体酵母菌株y1h(pabai-soc1-2+agl24)能在含有相应aba背景浓度下的培养基sd/-leu/aba150上正常生长,而其他的均不能生长。为了进一步鉴定芥菜soc1启动子截短体与agl24在植物体内的互作情况,本试验分别将soc1启动子的三个截短体与双萤光素酶表达载体pgreenii0800-luc连接,得到重组质粒luc-soc1-1、luc-soc1-2和luc-soc1-3,通过冷热刺激法分别转化农杆菌感受态gv3101(psoup)。然后分别将转有启动子片段的农杆菌菌液和转有agl24蛋白的农杆菌菌液按od600比值1:9混合均匀。再将混匀的菌液分别侵染6片真叶的本氏烟,60h后在glomax?-multi+多功能检测仪上检测萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶的活性,并计算萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶的比值。结果表明:所有试验组的比值均显著高于阴性对照组的比值。说明三个截短体socl-1、S0C1-2和S0C1-3均能与agl24蛋白在植物细胞内相互作用。4.芥菜soc1的启动子carg-box突变体与agl24相互作用检测为了更进一步分析agl24蛋白是否特异性的结合到soc1启动子截短体上的carg-box基序,本试验提取实验室已构建好的两种soc1启动子突变体片段(carg-box内a-t碱基互换突变及carg-box删除突变体)与酵母表达载体连接的重组质粒,然后将其分别转化酵母感受态菌株y1h。筛选出抑制酵母菌株ylh(pAbAi-SOCI-IE)、Y1H(pAbAi-SOC1-2E和Y1H(pAbAi-SOC1-3E生长的AbA最低浓度分别为100ng/mL、150ng/mL和200ng/mL,抑制酵母菌株YIH(pAbAi-SOCI-ID)Y1H(pAbAi-SOC1-2D和口Y1H(pAbAi-SOC1-3D)生长的AbA最低浓度分别均为100ng/mL。然后将酵母重组质粒pGADT7-AGL2分别转化到Y1H(pAbAi-SOC1-1E)、Y1H(pAbAi-SOC1-2E)、Y1H(pAbAi-SOC1-3E)、Y1H(pAbAi-SOC1-1D)、Y1H(pAbAi-SOC1-2D)、Y1H(pAbAi-SOC1-3D酵母感受态细胞中。结果发现：所有二倍体酵母菌株均不能在含有相应AbA背景浓度下的培养基SD/-Leu/AbA上正常生长。为了进一步确定芥菜SOC启动子突变体片段与AGL24在植物体内的互作情况，本试验分别将SOC启动子的6个突变体片段与双萤光素酶表达载体pGreenII0800-LUC连接,得到重组质粒LUC-SOC1-1、ELUC-SOC1-2、ELUC-SOC1-3ELUC-SOC1-1DLUC-SOC1-2DLUC-SOC1-3D并将重组质粒通过冷热刺激法分别转化重组农杆菌GV3101(pSoup)，按OD6O0的比值1:9将启动子突变体片段与AGL24蛋白混合均匀。然后将混匀的菌液分别侵染6片真叶的本氏烟，60h后在GloMax?-Multi+多功能检测仪上检测萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶的活性,并计算萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶的比值结果表明:所有试验组的比值与阴性对照组的比值差异不显著。说明SOC1截短体小片段CArG-box内A碱基与T碱基互换或者删除CArG-box后，均不能与AGL24蛋白发生相互作用。以此推断:SOC1与AGL24之间的相互作用会受到CArG-box1、CArG-box2和CArG-box3特异性调控。5.芥菜AGL24转基因表达载体构建及其转化芥菜根据AGL24基因全长序列，并结合植物双元载体pBI121的多克隆位点，设计引物并选用合适的酶切位点。构建表达载体pBI121-AGL24,转化芥菜幼苗下胚轴，在MS养基上经预培养、侵染、共培养、筛选培养、分化培养等，然后再炼苗移栽，成功获得转AGL24基因的芥菜植株

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