LC/MS/MS定量
分析
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的一般步骤准备工作查阅文献做好样品前处理，萃取，浓缩，分离，纯化。有条件的可先在HPLC上摸好LC条件，能够基本分离更好，缓冲体系符合MS要求。溶剂包括水的纯度，最好色谱纯以上。新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净，某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，用溶剂清洗。质谱仪必须校准，预热时间要足够长，气流的稳定也很重要，液氮气阀开度要注意，达到稳定程度。MS条件优化先定性后定量首先，确定离子化方式：ESIorAPCI，POSorNEG用10-100ppm的纯样，Q1SCAN查看存在那些离子，要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP，观察离子的增减，若为POS方式，看M+1，M+18，M+23等等，初步判断分子离子，如看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适，或选择的溶剂体系不合适。母离子选M+H，或M-H最好，但有时只有M+NH4，M+Na等，这样CAD能量需要可能高些，选择〔M+H〕+，还是+NH4，Na等，要由化合物决定，加合离子若稳定则可用，不稳定则可能需要换流动相，但+H通常好些，所需碰撞能量低，灵敏度高。如含CL可选择2个母离子峰。SIM与MRM，单级Q只能SIM，MRM可看成2个SIM，选择性更好。再根据上一步确定的较纯的母离子进行PRODUCTSCAN，确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息，还可改变CE，从中选定MRM一对或更多离子对，为最后LC/MS/MS联用做准备。做PRODUCTSCAN时，注意小数点后的位数，MRM输入要准，灵敏度才高。先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据法规要求确定离子对数目。MRM方式优化仪器，通过优化仪器参数，使得母、子离子都达到一定强度的平衡，使MRM灵敏度最高。可先让仪器自动优化参数，然后再手动细致优化，只检测一对离子时，要根据每对离子的XIC强度来分别确定仪器参数。先用注射泵优化COMPOUND项下面的参数，如DP，CE，CAD等，再接通LC用FIA优化其他参数如温度，气流和IS电压及离子源位置，或接一个三通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC保持需要的流量，然后进行MRM测定。CURTAINGAS在不降低灵敏度情况下尽量大些，温度在达到灵敏度时不用太高，气流也不用太大，这样可以提高信噪比，保持信号稳定。分辨率的选择：当样品较纯，Q3可选LOW，提高灵敏度，若选LOW后本底噪声太大则意义不大。LC条件优化：色谱柱长度可根据分离的要求而定，定性可长些，定量在能有效排除干扰情况下尽量短，提高效率；内径最好选细径柱如2mm，1mm，IS可不分流，4.6mm柱用1ml流量时如不分流灵敏度还不是最佳，不如流量低时更好。流速高，峰形好。不同牌号色谱柱，效果很可能不同。PH的影响：正离子方式PH要低些，负离子方式PH要高些，除对离子化有影响外，还影响LC的峰形，以至定量误差。流动项加乙酸铵可适合大部分测定的要求。LC/MS/MS与LC/UV比较：通常/MS/MS因选择性好，灵敏度高，定量跟准确，但质量范围很宽全扫描时不一定灵敏度高。LC梯度的设定，目的是快速分离，峰形好，缩短时间，提高效率，选短柱亦是如此。溶解稀释被测物最好用流动相，或尽量接近的体系，否则可能峰形不好，变宽，出怪峰等使定量不准。用流动相配的标样，初步优化确定LC条件是否合适，标准品工作液现配现做，尤其是较低浓度，时间长了可能因吸附分解等降低。进样顺序要先稀后浓。洗针液要常换，进过浓样后要进一针空白，检验是否有残留污染。顺序：纯样-添加样-实际样品。流动相优化后，空白提取液配制标准再优化，看干扰，空白添加再提取后看回收率。用空白提取液配制标准样做曲线，准确，有效排除干扰因素。前处理方法的优化LC，MS都优化还不行，改提取方法。离子抑制-改变前处理方法或LC条件。内标用法，药代动力学时多采用内标，选择原则：内标物与待测物的化学性质有区别时，要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同，尽量选同系物。还可利用同位素标记。衍生化-稳定，信号强，例如硝基呋喃类，衍生化后容易测量。优化质谱仪器，调整LC参数，选择进样方法等所有的工作都是为了使仪器的灵敏度最高，选择性最好，使得被分析物能够被准确无误的测定。数据处理最低检出限，信噪比2：1，定量限10：1。同一物质几对离子的比例应相对恒定，误差不超过15%；峰面积比峰高更准确。当浓度低，信号弱，自动积分不准时可对峰面积手动积分。平滑次数与峰宽因子，保留时间。曲线过零点可用4个点，不过，则要用5个点。线性范围太宽无益。几种算法的意义，1/X，1/X2结果列表，分组，METRICPLOT，出报告。重复步骤-
流程
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图多种方法同时编入批处理清洗，降温，关机程序自动STANDBY。
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