Feynman_R汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养
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面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。最近的一个实验是：3×106细胞电转后，我把电激杯中的细胞分别接种1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小时后加g418筛选，这个时候接种了1/300细胞的孔会大约50%汇合，而理论上接种了1/4000细胞的孔会4%左右汇合，今天是筛选后第9天，观察到1/4000孔有两三个小克隆，按道理1/300孔会有20-30个克隆，但实际的情况是它们几乎全部死光了，仅有少数存活细胞！所以我认为汇合度对g418筛选影响很大，这耽误了我将一个多月。jiangql同意菊花与刀对你的建议。我的感觉G418筛选时间太长，到后来一般会对细胞生长有影响。以下是一些建议，供参考：首先需要扩增细胞，冻存部分中间产物细胞后，再做克隆化比较合适，否则一旦污染就会全军覆没。一般5～7天后G418就可以减半维持。勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。血清浓度可以高到20％，质量要好。进行真核转染的一般程序：克隆目的基因（经测序验证）—准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。一、 试剂准备1、HBS（Hepes-bufferedsaline）：876mgNaCl溶于90mlddH2O，加入1MHepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml,pH7.4，滤过除菌。2、核酸贮存液，过滤除菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。二、操作步骤（一）克隆目的基因1、根据GenBank检索的目的基因序列，
设计
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扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。2、回收特异性扩增片段，连入T载体。3、转化DH5α，质粒制备。4、酶切初步鉴定，测序证实。（二） 真核重组表达载体的构建：pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收插入片段和pcDNA3线性片段T4连接酶连接转化DH5α质粒制备BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：1、G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。典型贴壁细胞平板密度 培养板大小 生长面积（cm2） 大约细胞数 培养基容积（ml） 组织培养皿（φ60mm） 28 6．6×105 5-6 6孔培养板（φ35mm） 9.5 3×105 1-2 12孔培养板φ22.6mm） 4 1．3×105 0．5-1 24孔培养板（φ8mm） 0．5 0．6×105 0．25-0．53、 SHG-44细胞的转染：(1) 转染当天，加入脂质体/DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。(2) 准备不同比例的DOSPER/DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。①溶液A：用HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5μg到总体积50μl（30μg/ml）。②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl（120μg/ml）。③混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。(3) 不要移去培养基，逐滴加入100μl脂质体/DNA混合物（从培养孔一边到另一边），边加边轻摇培养板。(4) 37℃孵育6hr。(5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。(6) 转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。4、 G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。
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