ALCAT1介导心肌肥厚的病理进程及调控线粒体氧化应激和自噬的机制（可编辑）

ALCAT1介导心肌肥厚的病理进程及调控线粒体氧化应激和自噬的机制（可编辑） 密级 博士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 介导心肌肥厚的病理进程及调控线 粒体氧化应激和自噬的机制作者姓名: 刘晓磊 学科专业: 药理学 学院系、所: 药学院 指导教师: 李元建教授 史裕光教授 程泽能教授 、 / 答辩委员会主席么堕竺,\苎 答辩委员会主趣一 中南大学 年月 原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和 致谢 的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果, 也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。 与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 。 日期:独兰年上月卫日 作者签名:剑堕毳 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文, 允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内 容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》, 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名:勤盗盘导师签名釜至塾日期:筮丝,年』野博士学位论文 中文摘要 摘要 氧化应激和线粒体的受损是引起心肌功能不全和心衰的重要原 因,但其机制仍未被完全研究和阐述清楚。心磷脂是参与氧 化磷酸化和维持心脏功能所需的一种线粒体的磷脂,其支链结构 长度 的改变,酰基不饱和度的异常和脂质过氧化程度的增加与心功能障碍 有关。心磷脂乙酰转移酶是~种的重要的酰基转移 酶,它对的支链结构有重构性的修饰作用,由于对 的病理重构是很多心脏病的普遍现象,而且本身可被氧化 应激和年龄相关的代谢性疾病所诱导而表达上调,因此我们研究在心 肌肥厚疾病中,对心脏病理发展的可能作用和影响机制。在 小鼠模型中,考察的敲缺对引起的心肌肥厚程度,心肌 功能受损的程度,心室纤维化的程度,线粒体的损伤,和相 关的线粒体自噬程度的影响。在细胞株中,我们考察 高表达对氧化应激和脂质过氧化水平,的拷贝数,细胞骨架蛋 白的重构和细胞形态的影响。在细胞上,考察的敲除 对氧化应激引起的线粒体损伤和碎片化程度的影响。整个研究结果, 确定了具有对重构作用的在心肌肥厚和心脏功能不全的 病理进程中有重要的介导作用,其机制与氧化应激,线粒体的氧化损 伤,自噬体系的调控等有关,整个研究结果表明了在心脏病 源学研究中的意义。 本课题主要研究结果如下: .的敲除减轻了甲状腺激素诱导的小鼠心肌肥厚的表 型,包括小鼠的心脏和体重比值,左心室厚度和心肌功能,心 肌细胞的容积,心室纤维化程度,心肌细胞肥厚和纤维化的标 志物水平,和组织脂质过氧化程度。 .从蛋白水平确证了在小鼠心肌肥厚的病理组织中表达 上调。 .的敲除减轻了甲状腺激素诱导后的心肌组织中的线粒 体损伤程度。 .的敲除增加了和在小鼠心肌中的表达水平 .的敲除不会影响短期甲状腺激素处理对心肌中通博士学位论文 中文摘要 路的激活程度,但会在一定程度上减轻或逆转长期甲状腺激素 处理对心肌组织中通路的抑制程度。 .构建和筛选出稳定高表达和的细胞株。 .在细胞株上,的高表达增加了细胞的容积和增殖 速度,阻断了细胞分化能力。 .的高表达增加了线粒体氧自由基的产生速度,以 及氧化应激诱导的脂质过氧化程度和的氧化缺失。 .的过表达和敲除改变了骨架蛋白在和细胞 内的分布。 .介导了和细胞中的线粒体网络结构在碎片 化和连续管状结构的转换,的敲除可以减轻氧化应激 引起的线粒体碎片化程度。 .的高表达减少了在中的表达,的 敲除增加了在的表达。 .的敲除减缓了的细胞衰老进程。 .引起的氧化应激诱导了的胰岛素信号抵抗。 .的高表达阻断了甲状腺激素对通路的磷酸化激活。 总之,本课题在甲亢诱导的心肌肥厚模型中,考察的敲 除对心肌肥厚表型的影响,从分子机制和信号传导通路的调控等方面 进行机制的探讨。在和细胞水平上研究对细胞形 态,增殖,分化能力,氧自由基产生,以及氧化应激诱导的脂质过氧 化度和线粒体缺失,线粒体网络结构和自噬,骨架蛋白重构和胰岛素 信号通路的影响。我们首次发现在甲状腺激素诱导的心肌肥 厚病理进程中的调控作用,并发现其机制跟氧化应激,线粒体的融合 和分裂,线粒体氧化损伤和自噬体系,以及病理状态下信号通路 的上调有关。研究结果为其它心脏疾病的分子病理机制研究提供了新 思路,为临床的心肌肥厚和心衰等疾病的药物治疗提供了新的靶标。 关键词一磷脂,心磷脂乙酰转移酶,氧化应激,线粒体自噬,甲状 腺激素,心肌肥厚,融合和分裂,信号通路 ?博士学位论文 英文摘要 . . . . . . ,., , , .., ,. .,, ,, ,, . ... 英文摘要 博士学位论文 . . . . ., . ?. ... ,, .. . , . ... .. . .. . 匝. 匝 . .. .. . .,, , 博士学位论文 英文摘要 , . , , ,, .. . .,, ,,博士学位论文 目录 目 录 中文摘要 英文摘要??.. 前言?. 日 吾 第一章在甲状腺激素诱导心室重构的病理作用一 .研究背景.材料和方法? .试剂和设备??. . 基因敲除鼠的饲养? . 基因型的分析 . 甲状腺激素诱导心肌肥厚模型的建立??. .超声心动图检查??. .实时荧光定量分析.心肌组织脂质过氧化分析?. . 染色和’ 染色. .数据处理和统计学分析??. .结果. 小鼠基因型的分析结果? . 敲除对小鼠体重和甲状腺素脱碘酶的影响??. . 甲状腺激素处理对心室组织中表达水平的影响 .心室组织中氧化应激和脂质过氧化度分析。 .心室重量,厚度和心肌功能分析?. .小鼠心脏的形态学和心肌细胞的面积分析. . 提取质量和心肌肥厚生物标记物的测定.小鼠心肌纤维化程度考 察?. . 的敲除对心室组织中线粒体超微结构和线粒体自噬的影响?. .甲状腺激素对和敲除小鼠心肌的信号通路影响?。 .讨论 .结论第二章影响心肌肥厚进程的分子及信号机制? .研究背景.材料和方法? .试剂和设备?. .细胞的培养,冻存和复苏?. .稳定细胞株筛选??. . 细胞的分离和培养目录 博士学位论文 .细胞株增值和分化?. .细胞容积比较. .细胞线粒体氧自由基的测定. .细胞脂质过氧化的测定??. .细胞的测定.. .共聚焦显微镜分析骨架蛋白和线粒体的碎片化? . 电子显微镜分析线粒体的形态.实验方法??.. .分析条件??.. . 对?表达水平的调控??.. . 高表达对氧化应激诱导的自噬信号调控 . 生长曲线和生物标志物衰老相关.半乳糖苷酶的分析?. . 对胰岛素抵抗的调控. 对甲状腺激素诱导通路激活的调控??. . 长期和短期诱导后心肌组织中的信号通路.数据处理和统计学分 析.结果?. . 稳定细胞株筛选结果. . 提高了的增值速度.. . 对分化能力和形态学影响。 . 对细胞容积影响?. . 增加了线粒体的氧自由基产生?. . 增加了氧化应激诱导的脂质过氧化度?. . 增加了的氧化损伤??.. . 高表达对线粒体网络结构的影响. . 的敲除减轻了线粒体的氧化损伤. . 对自噬体系的调控 . 对自噬体系的调控 . 对细胞衰老的调控 . 对细胞骨架蛋白的影响? . 诱导心肌细胞的胰岛素抵抗. 对甲状腺激素诱导通路激活的 抑制??. .讨论?. .结论? 参考文献??.. 综述??. 致射??. 攻读博士学位期间主要研究成果?.. ?博士学位论文 英文缩写词表 英文缩写词表 缩写 英文名称 中文名称 心磷脂 心磷脂乙酰转移酶和单溶血心磷脂乙酰转移酶磷脂酰甘油磷酸 合成酶。 脂酰甘油磷酸 心磷脂合成酶 溶血磷脂酰 ,溶血磷脂酰乙酰转移酶 . 胞浆磷酸脂酶氧自由基分化培基 ?匝小鼠胚胎成纤维细胞视神经萎缩 电压依赖阴离子通道 ? , 甲状腺激素 . .甲状腺素,? ,’,三碘..甲状腺素钠盐 二十二碳六烯酸 ,’,,’四油酸亚基一 ,’,,’信使 代巴比妥酸活性物质线粒体 ’实时荧光定量 超氧化物歧化酶 ?博士学位论文 英文缩写词表 野生型 敲除 脑钠肽 心房钠尿因子 .骨骼肌一肌动蛋白 ? 肌球蛋白重链 脂质过氧化产物 丙二醛 .羟基壬烯酸磷酸甘油醛脱氢酶苏木素.伊红 .心舒末期室间隔壁厚度 左心室舒张末期内径一 左室后壁舒张期厚度左心室收缩末期内径室收缩同步性 ? 左心室射血分数 ? 衰老相关一半乳糖苷酶 甲状腺脱碘酶 博士学位论文 刖舌 前言 心磷脂,最初从牛心肌中分离出来并确证为一种磷脂,它 定位于线粒体内膜,在维持正常心肌的生理功能上有很重要的作 用。结构含 有两个磷脂,中间通过的一个甘油酯结构连接在一起,每个磷脂含有两个脂肪基 侧链,因此它具有四个脂肪酰基侧链,是唯一的一种双聚体形式的磷脂【刁】。 这种独一无二的结构特性被认为有维持线粒体膜两侧的质子梯度和影响氧化磷 酸化呼吸链上酶系的作用【】。 对线粒体的功能的影响多方面的。首先可以提高线粒体呼吸链上氧化 磷酸化的效率,这有两个机制,第一,具有稳定呼吸链一系列复合物的排列 顺序,这些复合物称为超级复合物,,另外还参与到复合物 中/载体的转运过程,有利于提高呼吸链中电子传递和与 交换的效率【’;第二个机制是可以作为质子阱 限制质子在呼吸 链上流动【』, 的缺失会降低膜电势差,并会影响到线粒体骨架蛋白和外膜蛋 白的合成,这被认为是巴氏症的重要病卧,。对线粒体的网络结构有影响作 用,因为线粒体是高度动态变化的细胞器,存在融合和分裂的形态变化,线粒体 ,参与,而可以提 的融合需要短链的视神经萎缩 高短链的的活性【 ’ 的另一个重要作用是对线粒体嵴的形态结构影 响,的缺失会造成嵴的结构异常【,】。 的结构变化具有重要病理的意义。新合成的必须经过一种重构过程才 能发挥生物学活性,这个重构过程由磷脂酶类和酰基转移酶/转酰酶参与,将亚 油酸纳入其脂肪酰基链。临床上发现,在心肌肥厚引起的心力衰竭期时,啮齿动 物和人类心肌都缺失了健康心肌应有的四个脂肪酸侧链】。由磷脂酸开 始经一系列的生物反应而合成,而重构的先天缺陷会造成扩张型心肌的巴氏 症,这是一种严重的连锁遗传性疾病,生理学特征为侧链的亚油酸含量不 足,线粒体功能障碍,生长迟缓和嗜中性白血球减少症【,】。此外,发现侧 链的酰基不正常重构的现象可能与年龄的老化和老年化疾病的发生有相关性,这 包括糖尿病,肥胖,心血管疾病,神经退行性疾病等许多线粒体功 能障碍引起的 疾病,所有的这些病理都表现出氧化应激,缺乏,中二十二碳六烯酸 】。 的富集,和线粒体功能的障碍【 氧化应激一直以来被认为是线粒体功能障碍和胰岛素抵抗的一个重要诱发 因素,在心肌发病和心功能不全的病理进程中也发挥了重要作用【。越来越多 的证据表明心肌肥厚和心肌功能的不全与氧化应激的增加有相关性【】。减少氧 化应激的产生可以预防左心室的重构和心肌功能的不全【】。在所有的磷脂类中,博士学位论文 日舌 对活性氧引起的其双键的氧化损伤是高度敏感的,这个过程被称为 脂质过氧化,原因在于其侧链的不饱和脂肪酸的含量较高,而且定位在线粒体内 膜的邻近产生的位置。因此,是线粒体内在细胞凋亡期间最先发生 氧化过程的一种磷脂【】。尽管过氧化产生的分子机制尚不完全清楚,但现己 证明的增加能提高对氧化损伤的敏感性,其结果会促发脂质过氧 化和 线粒体的功能障碍的恶性循环【】。另外,的含量随着机体的衰老而增加, 并伴随着的逐渐缺失】。心肌缺血再灌注损伤引起的过氧化反应,导 致细胞色素氧化酶的活性显著下降,这仅能通过新生的来修复,而其它的 磷脂类或过氧化的没有修复作用。另外,人类甲状腺功能亢进症的发病与 氧化应激升高和过氧化作用有关,而甲状腺机能的恢复正常能使这种程度减 轻?’驯。甲状腺功能亢进症会刺激啮齿类动物的重构,结果引起多不饱和脂 肪酸的含量和过氧化应激指数的显著增加【,。 对于哺乳类动物,的生物学活性和功能由它的脂肪酰基侧链的结构决定, 在心脏和骨骼肌这些代谢性组织中其侧链的碳原子和酰基比以:为主要构成。 而参与生成的酶基本都不具有乙酰化修饰的作用,因此影响其支链结构组成 的过程主要是合成后的乙酰化和去乙酰化的修饰过程【】。关于的重构过程包 括两种不同的机制。第一种机制是乙酰基从磷脂酰胆碱或磷脂酰 乙醇胺转移至 ,这个过程部分受蛋白催化,而基因的突变会造成重构 的障碍【。另一种机制是首先由磷脂酶催化的去酰基化,而后是 乙酰辅 酶依赖性的由心磷脂乙酰转移酶和单溶血心磷脂乙酰转移酶 催化的乙酰化修饰【,具体过程见图,的结构在此过程中的 变化如图。 之 仃? 矗 ?? 啪鱼型:嘣照啪 啪鱼?山二,。嘣照啪 跚 。七讯删?四 脚口 撤?。? 图.的合成和介导的重构过程。磷脂酸 目?舌 博士学位论文 磷脂合成, 多磷酸肌醇磷脂,磷脂酰肌醇,一磷酸 甘油., 卵磷脂, 胞嘧啶二酯酰甘油.,磷脂 ,磷脂酰甘油磷酸合 酸胞苷酰转移酶 脂酰甘油磷酸 ,, 成酶 ,,心磷脂合成酶 , ,磷脂,溶血磷脂酰,, 溶血磷脂酰乙酰转移酶 ,,胞浆磷酸脂酶 ,,心磷脂,,心磷脂酰基转移酶 ,图.介导的重构过程中的结构变化。 人源为主要表达在骨骼肌和心肌中,定位于内膜层,具有溶血 磷脂酰基转移酶的功能,参与心磷脂的重构【 。酰基转移酶以磷脂类为底物包 括心磷脂,进行酰基化或去酰基化的修饰过程,可以通过一系列 的乙 酰化和去乙酰化过程修饰心磷脂的四个乙酰基的侧链【】。染色 体上的 基因的缺陷,导致重构的的不足和的缺乏,表现出的典型症状 是心肌肥厚和心衰,骨骼肌无力,发育的迟缓和嗜中性白血球减 少【。染色体 上的突变不仅会造成病人体内含量的不足,而且中侧链的比值为 :的亚油酸和其中间体磷脂酰甘油含量也相对减少,,还有研究发现在 正常骨骼肌和心脏中常见的含有四个亚油酸侧链的在巴氏症患者上是缺失博士学位论文 刖看 的,但其它磷脂类的侧链组成没有发现有缺失的情况【。 是一种心磷脂酰基转移酶,它在细胞内定位于线粒体相关膜上,具有乙酰化溶血磷脂的作用,对于长 链不饱和脂肪酰基的侧链有较强的乙酰化修饰作用【,,】。在小鼠胚胎成纤维细 胞中高表达会降低总的含量,降低成熟的的比例和增大含多不 饱和脂肪酸侧链的比例,这些变化通常都是与线粒体的功能紊乱是相关的【】, 在糖尿病,肥胖和心肌病引起的氧化应激情况下,可催化的病理重构,结果 导致的产生增多,线粒体功能障碍和胰岛素抵抗【,,】。本实验室最近对 的进行了鉴定和生物学特性研究,发现重组的定位于内质网 并以单链心磷脂和为底物【】。这两种机制中的乙酰基转移酶是至 今已研究最为明确的,两种参与重构修饰的酶在细胞内的亚定位和催化底物 不同。为了确证能通过乙酰化修饰的基因,及其对的重构作用和病理意 义,本实验室最近对的进行了鉴定和特性研究,发现重组的 定位于内质网并以单链心磷脂和为底物【】。有研究发现编码 的基因与线粒体三功能蛋白具有同源性【】。 由重构的后会产生带有酰基组成的支链,这种乙酰化的修饰产 物可能与一些心脏疾病的生理病理变化相关,如心脏内的缺失和含 侧链的富集,而特异性敲除可阻止了饮食诱导的肥胖症及其相关的 代谢性并发症的发生【引,还有研究发现,甲状腺功能亢进症可显著上调 在心脏中的表达,甲状腺功能减退症则下调其表达【】, 这提示了在氧 化应激的作用和心功能障碍的病因学作用。因此我们考虑是否参与或 介导甲状腺激素引起的病理进程,是否对甲状腺激素引起的氧化应激有调控作 用,以及是否调控氧化应激对线粒体损伤过程。 本研究首先使用甲状腺激素诱导的小鼠心肌肥厚模型,验证在心肌 肥厚发生发展中的病理进程作用。然后在细胞水平考察对线粒体 氧自 由基产生速度,脂质过氧化程度和线粒体氧化损伤程度的影响。 因为骨架蛋白.对心肌细胞的功能有重要的影响作用,因此需要考察 的高表达和敲除是否影响.在和细胞内分布。因为线 粒体的网络结构是高度动态变化的,存在融合和分裂动态 平衡,对线粒体的网络结构有影响作用,通过对的活性调节,维持线 粒体的融合结构【 ’,而氧化应激的损伤作用可造成线粒体的分裂和碎片化【, ?,我们知道对有病理重构作用,而且对氧化应激有调 控作用,因此我们推测可能会通过对的重构或者介导氧化应激水平 对线粒体的网络结构产生影响,我们用共聚焦显微镜观察是否能能调 博士学位论文 日舌 控细胞内线粒体的融合和分裂的动态平衡,以及的敲除是否能减轻氧 化应激对线粒体碎片化程度的影响。为进一步从线粒体超微结构分析线粒体的损 伤程度,我们电镜分析细胞中的线粒体的超微结构,观察线粒体的损伤程度。因 为线粒体的氧化应激可以促进线粒体的自噬,这是一种减轻氧化应激水平和保护 线粒体损伤的机制,我们考察是否对参与线粒体自噬的生物标记物的 表达水平有影响作用。因为氧化应激水平上升,线粒体功能紊乱和自噬能力的下 降,的突变和丢失等与是细胞的衰老的特征?书,因此我们考察 对细胞的衰老进程是否有影响作用。从信号传导上,我们需要分析的 高表达是否影响心肌细胞对氧化应激刺激的信号传导,如的高表达对 不同剂量胰岛素刺激和甲状腺激素不同处理时间后相关信号通路上的调控情况。博士学位论文 第一章 第一章.在甲状腺激素诱导心室重构的病理作用 研究背景 心磷脂,是参与氧化磷酸化和维持心脏功能所需的一种线 粒体的磷脂,是特异表达在线粒体内膜上的磷脂,是体内唯一的双聚体形式磷脂 【】。除了参与合成的过程还影响到线粒体的一系列生理活动,其支链 结构长度和酰基不饱和度的异常和脂质过氧化的程度与心功能 障碍有关,因此 代谢过程的改变被认为可能与一些病理进程有关【】。对线粒体的功能的影 响多方面的。首先可以提高线粒体呼吸链上氧化磷酸化效率,具有稳定 呼吸链一系列复合物的排列顺序,这些复合物称为超级复合物,另外还参与 到复合物中/载体的转运过程,有利于提高呼吸链中电子传递和 与交换的效率【,。的双聚体结构可以作为质子阱 限制质子 在呼吸链上流动【’引。的缺失会导致膜电时差的降低,这将会影响到线粒体骨 架蛋白和外膜蛋白的合成,这被认为是巴氏症的重要病斟’。对线粒体的网 络结构有影响作用,因为线粒体是高度动态变化的细胞器,存在融合和分裂的形 ,参与, 态变化,线粒体的融合需要短链的视神经萎缩 而可以提高短链的的活性【 ,】。的另一个重要作用是对线粒体嵴 的形态结构影响,的缺失会造成嵴的结构异常。 新合成的必须经过一种重构过程才能发挥生物学活性,这个重构 过程由 磷脂酶类和酰基转移酶/转酰酶参与,重构的异常会影响其生物学活性并具有 重要病理的意义【】。临床上发现,在心肌肥厚引起的心力衰竭期时,啮齿动物和 人类心肌都缺失了健康心肌应有的四个脂肪酸侧链【 。侧链的酰基不正 常重构的现象可能与年龄的老化和老年化疾病的发生有相关性,这包括糖尿病, 肥胖,心血管疾病,神经退行性疾病等许多线粒体功能障碍引起的疾病,所有的 这些病理都表现出氧化应激,缺乏,中二十二碳六烯酸的富集, ‘。 和线粒体功能的障碍 在的生物合成和重构的过程中,影响最终产物活性的步骤主要是重构过 程中脂肪酰基侧链的磷酸化,乙酰化和去乙酰化的修饰过程【。关于的重构 过程包括两种机制。第一种机制是乙酰基从磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺转移至 ,这个过程部分受蛋白催化,而基因的突变会造成重构 的障碍【。另一种机制是首先由磷脂酶催化的去酰基化,而后是 乙酰辅 酶依赖性的由乙酰转移酶催化的乙酰化修饰【引。病理重博士学位论文 第一章 构后的产物被认为可以引起氧化应激的增加和线粒体功能的紊乱【引。 是一种重要的心磷脂酰基转移酶,它对的支链结构有重构性的 修饰作用,活性的提高和对的重构修饰程度的增加是很多心脏病的 普遍现象,的高表达可以引起细胞水平的氧化应激和脂质过氧化程度, 以及线粒体的损伤【。在所有的磷脂类中,对活性氧引起的其 双键的氧化损伤是高度敏感的,这个过程被称为脂质过氧化,原因在于其侧链的 不饱和脂肪酸的含量较高,而且定位在线粒体内膜的邻近产生的位置。 因此,是线粒体内在细胞凋亡期间最先发生氧化过程的一种磷脂【引。尽管 过氧化产生的分子机制尚不完全清楚,但现已证明侧链的增加能提高 对氧化损伤的敏感性,其结果会促发脂质过氧化和线粒体的功能障碍的恶性循 环,而侧链的产生主要通过的乙酰化作用而产生【钔。因此 介导的重构可能介导氧化应激和线粒体损伤的过程。 心肌肥厚是心肌功能不全和心衰的前期临床特征。氧化应激和线粒体的受损 是引起心肌功能不全和心衰的重要原因。氧化应激和线粒体的受损存在恶性循 环,氧化应激会直接损伤线粒体,线粒体功能的损伤会增加氧化呼吸链上质子泄 露程度,引起氧自由基增多,增多的氧自由基通过线粒体通道释放出来, 进而引起内质网氧化应激,增加的氧化应激又迸一步损伤线粒体功制引。但这 种循环的分子机制及其病理意义仍未被完全研究和阐述清楚。我们推测 介导的重构可能介导氧化应激和线粒体损伤的循环过程,从而影响心肌功能 不全和心衰的病理进程。 各种机械刺激,化学因素作用都可导致心肌肥大。心肌肥厚表现为心肌细胞 实质成分的肥大,和心肌问质纤维化和血管的病变。心肌细胞的肥大促进了心肌 细胞内蛋白质的合成,病理表现为心室壁增厚、心腔扩大、心室重量增加,心肌 纤维化是指间质成纤维细胞的肥大增生及其合成的胶原含量增加,心脏纤维化是 心衰和其他心脏并发症的进展中的有害因素之一?】。我们使用甲状腺激素给药 方法诱导心肌肥厚模型,出于一下几点考虑: 首先,甲状腺激素对氧化应激和线粒体呼吸有重要调控作用。甲状腺激素 对线粒体的重量,细胞色素的含量,呼吸速率,和氧化代谢的容量等都有影响 作用。甲状腺功能亢进症与与线粒体功能紊乱有相关性。因为心脏对能量供给的 需求很高,因此对甲亢引起的氧自由基损伤有高度的敏感性,例如甲亢患者表现 有心动过速和心功能恢复较慢的症状,在心肌缺血再灌注时,线粒体产生高水平 的氧自由基和出现肿胀【】。而氧化应激是心肌损伤,心肌纤维化和心血管系统 结构、功能异常的重要发病原斟,】。 其次,甲状腺素诱导的心肌肥厚动物模型符合甲亢性心脏病的病理特点,过 博士学位论文 第一章 量甲状腺素可促进心肌细胞蛋白质的合成,提高心输出量和细胞氧耗,最终导致 心肌缺氧缺血性肥厚【】,甲状腺素通过激活腺苷酸环化酶,从而使心率加快, 心肌收缩力增强,代偿性心肌肥厚,心室扩大,晚期心肌收缩力减低,还可引起 心脏传导纤维水肿和损害而导致各种类型的传导阻滞。 而且,甲亢和甲减都能影响到氧化应激的水平,脂质过氧化,以及的水 平和支链的组成情况】。从重构方面看,甲亢会引起侧链的:的 丢失,并同时伴随有侧链中多个不饱和脂肪酸的含量增多,如:和:的 含量增多,这些侧链结构上的变化增加了的侧链不饱和度数%和过氧化 度指数%,这些变化可能会引起氧自由基的生成增多【。 已有研究表明,甲状腺功能亢进症可显著上调在心脏中的表 达水平】,而且的活性在大鼠的甲亢模型的心肌中是增加的?】,这提示 可能在甲状腺引起的心脏疾病中具有介导作用。 本研究使用甲状腺功能亢进症的小鼠模型,考察的敲除对心肌肥厚 和心衰的病理进程影响,包括心脏的和体重的比值变化,心脏的 形态学,心肌细 胞的形态学,心室厚度和功能,心肌受损引起的纤维化程度,心肌 细胞肥厚的生 物标记物,心肌组织中的氧化应激水平,脂质过氧化程度和信号 通路研究。 .材料和方法 .试剂和设备 实验中使用到以下抗体:和抗鼠单克隆抗体购自: :., 和,抗鼠单克隆抗体购自 磷酸化和,磷酸化,?和,磷酸化 和,磷酸化/和,磷酸化./和 ,磷酸化//和/,以上均为多克隆抗体, 为单克隆抗体,以上均购自 ,。多克隆 抗体购自 公司。多克隆抗体购自 田。多克隆抗体购自台湾。标记驴抗兔二 抗购自 ,。多克隆抗体为实验室自 制。.甲状腺素.,和,’,.三碘..甲状腺素钠盐,, ,购自。西门子 . 仪器公司。 彩色超声诊断仪。 :, 。试剂盒,:。 多功能吸 光度分析仪。 电子显微镜分析。磷屏扫描仪。第一章 博士学位论文 . 基因敲除鼠的饲养 实验动物采用野生型和基因敲除小鼠,两种基因型 的小鼠均为/ 品系,实验过程使用到的小鼠都通过方法进 行过基因型的确证,所有小鼠的繁殖,饲养和动物造模均在宾夕 法尼亚州立大学 动物实验中心进行,动物饲养在人工控制的光照环境中,期间可 自由饮水并被给 予 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 啮齿类动物饲料 ,,。涉及动物 的所有实验均按照批准的动物护理制度执行,并且使用 协议 离婚协议模板下载合伙人协议 下载渠道分销协议免费下载敬业协议下载授课协议下载 依照 指南 。 . 基因型的分析 我们采用 方法确证野生型和基因敲除 小鼠的基因型。 ..鼠尾的基因组提取 鼠尾的基因组提取采用 试 剂盒:,。小鼠出生周后分笼,并剪取约.长度的鼠 ./ 尾放入.离心管,每段鼠尾加入 .,此 ,和.灿蛋白激酶,置于轻微振荡过夜。第二天每管加入 /,于孵育时。然后加入“并涡旋振荡秒,样本于冰上孵育分钟后, 高速离心分钟,转移 上清液,加入 的异丙醇,上下轻微颠倒至有白色丝状沉淀产生,高速离心 分钟后,倾掉上清液,用%的乙醇溶液清洗沉淀,最后将沉淀物在 室温晾干, 加入的纯水溶解沉淀的。样本稀释倍后,用紫外分光光度计测定 值, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 基因组的浓度,冻存于.备用。 ..基因组的消化,电泳分离和转膜 用限制性内切酶:, 进行消化,在此体系中加入 的基因组和单位的内切酶量,酶切 在 中孵育过夜。第二天,加入的上样缓冲液,在.%的 琼脂糖凝胶和缓冲盐中电泳分离。琼脂糖凝胶在./ 和 ./. 碱性溶液中变性分钟,然后用./和./ 清洗两次以中和碱性溶液。在采用湿法转移片段至尼龙膜., 。 小时后,取出尼龙 : ,湿法转膜 膜用紫外交联固定分钟,置于备用或立即进行探针的杂交。 ..放射性探针的制备放射性探针用 :进行制 备,取探针片段/,此和此纯水至体系,经 博士学位论文 第一章 孵育分钟,然后冰上放置分钟,作为。另取.的, .此的, ,:/ ,及此的 混合后,置于孵育小时,然后用 ,将混合液与 柱:.,过柱纯化,将纯化标记的探针溶液 冻存于.备用。 ..探针标记和磷屏检测 将尼龙膜放入的 中封闭,然后加入变性分钟的探针 溶液,于孵育过夜。第二天倾倒含探针的 于放射性回收瓶内, 用/.%于室温条件清洗尼龙膜三遍,再用. /.于清洗三遍,用磷屏 压片过夜, 扫描分析同位素信 号。 .甲状腺激素诱导心肌肥厚模型的建立 选择野生型和基因敲除同年龄段.周龄的小 鼠,每种基因型各分为两组,每组只,一组为甲状腺激素处理组, .,毫克/公斤体重每天,腹腔注射,用. 和.%氯 化钠溶液作为溶解介质,每天腹腔注射一次,每次按毫克/公斤体重的剂量给 药,另一组为注射溶解介质的对照组。连续注射或溶解介质天后,进行 心室厚度检测的超生心动图检查。 .超声心动图检查 各组连续注射或溶媒介质天后,小鼠用苯巴比妥钠按小鼠体重的剂量 /体重麻醉,要求麻醉期间的小鼠心跳频率不低于次/分钟。应用西 子 彩色超声诊断仪,线阵探头检测以下参数:心舒 末期室间隔壁厚度,左心室舒张末期内径,左室后壁舒张期厚 度,左心室收缩末期内径,室收缩同步性,左心室射 血分数,心率 等。 .实时荧光定量分析 总的提取步骤: ?取一的心肌组织至水处理过离心管,加入 充 分匀浆,置于冰上分钟。 ?在每管中加入. 的氯仿,剧烈振摇秒,充分混匀,室温放置~ 后,, ,离心 。粉红色匀浆分成上层无色含 的水相和下层含的粉红色苯酚.氯仿有机相。小心取出上层含 的水相约. 至新的用.%的水泡过的. 管。 ?在每管中加入. 的异丙醇,剧烈振摇秒,室温放置 后, 博士学位论文 第一章 。 , ,离心 ?可见管底有白色胶状沉淀,去上清,在每管中加入 用 处理水配制的%乙醇,用以洗涤沉淀,重悬沉淀,放置 后, 。同样方法重复洗涤一次,离心。 ,离心 。 ?移去上清,室温风干沉淀~ 。溶 ?在每管中加入处理水此以溶解沉淀,约 解的用以电泳和值测定,保存于冰箱。 要求提取得到的经吸光度测定的值要求/...,电泳跑胶分析的:., 质量合格的用 ? : ,试剂盒进行的反转录。 反转录操作步骤: 冰上每管准备如下反应体系: 模板: 总 ? 引物: 肛 . / 处理水: 肛 轻弹管壁混匀,离心~ ; 。孵育 ,冷却离心: 放置冰上,依序加入如下物质: /.。? 轻弹管壁混匀,离心; 孵育 ; 加入 逆转录酶 /肛; 终体积: 孵育 : 终止反应,冷却; 。孵育 合成好的测定值,保存在.?冰箱待用。 实时荧光定量采用 ., 的荧光染料方法,实验前首先确定合适的模板和引物浓度,以 为内参,进行相对定量分析。心肌组织中的心肌肥厚和纤维化的 生物标 记物分析用到的引物为:博士学位论文 第一章 上游引物:’. .? 脑钠肽 下游引物:上游引物:’. . 心房钠尿因子, 下游引物:.’ 上游引物:’ .? 骨骼肌弘肌动蛋白.。 下游引物:’.配. 上游引物:’. 。 肌球蛋白重链,下游引物:’.’ . 上游引物:’. 型胶原 下游引物:’..’ 上游引物:’.. ?型胶原 ? 下游引物:’.. 上游引物:.’ 磷酸甘油醛脱氢酶, 下游引物:..心肌组织脂质过氧化分析 脂质过氧化是氧应激增强后发生的氧化生物膜的过程,即与生物 膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质 过氧化反应形成脂质过氧化产物 ,,如丙二醛, 和羟基壬烯酸一,屺,其中是脂质过氧化,也是 细胞氧化损伤的一个生物标记物。针对的测定,采用硫代巴比妥酸反应产物 ,法,这种方法可以检测大部分 氧化伤害产生的醛酮类质,因此的测定方法是衡量脂质过氧化的公认方 法。 在小鼠模型上,我们考察的敲除是否影响正常心肌组织的脂质过氧 化程度,以及在心肌肥厚的病理状况下的心肌脂质过氧化程度是否受 敲除的影响。因此我们考察心脏组织的脂质过氧化程度,使用试剂盒 ,:通过测量硫代巴比妥酸反应物 脂质过氧化反应产物进行量化。将新鲜的小鼠心肌组织剪碎,每组 取大约的量,加入预冷的 , , ,. , ,. , 第一章 博士学位论文 %, 超生匀 . 浆后秒,电压,高速离心,分钟,转移上清液测定总蛋白浓度,移取.总蛋白量的匀浆液,按照 .的说明书操作,处理后的样本用多 。 功能吸光度分析仪测定荧光吸收度激发波长: ,吸收波长: 结果以摩尔浓度与加入的总蛋白量比值来表示。 .衄染色和’ 染色 用苏木素.伊红染色既法察心肌肥厚后的组织形态学变化,剪取小鼠的 完整心脏,清洗血迹后,侵泡于%多聚甲醛中固定过夜。用石蜡包埋后, 切片置于载玻片上。分别用二甲苯,梯度浓度乙醇%,%,%,% 和蒸馏水依次清洗以脱去石蜡,用苏木素染色,盐酸乙醇分化后,用伊红染色染 色。脱水后用中性树胶封片。 胶原染色按照 试剂盒,:的说 明书操作。具体操作方法为: ?取含石蜡包埋组织的切片,进行梯度脱石蜡,将切片分别侵泡 于二甲苯, %乙醇,%乙醇,%乙醇和纯水中,每次.分钟。 ?用魏魏格特氏铁苏木精染片分钟,溶液配制方法:取试剂盒中 的溶 液%苏木精和%乙醇,和溶液.%氯化铁和%乙酸,临用 前将和以:的比例混合。 ?用纯水清洗染料溶液后,加入试剂盒提供的比布列希猩红酸性 品红溶液 . ,染色分钟,然后用纯水清洗。 溶液 ?取磷钼酸 ,磷钨酸 和纯水,按::的体积比例混合,立即放入切片染色.分钟。 ?用苯胺蓝 染色分钟,然后用清水清洗,加入含%乙酸 的溶液侵泡分钟。 ?用梯度法脱去水分,分别用%乙醇,%乙醇和二甲苯洗片。用中性 树胶封片。显微镜下观察组织的结构。 .数据处理和统计学分析 数据用平均值士标准平均误差表示。两组间比较用 检验分析。并且..认为差异有统计学意义博士学位论文 第一章 .结果 .小鼠基因型的分析结果 由于在小鼠基因组中基因序列的内含子中随机插于一段.序列, 经内切酶剪切后,两种基因型的片段相差.左右,基因敲除的原理 和方法参看文献报道【引。 对实验小鼠基因型确认的典型图谱如下图 .,实验结果确证了实验小鼠的基因型。 / / . . .. . .图. 法分析鼠尾的基因组,以鉴定野生型和敲除型。 和条带位置分别为.和.. . 敲除对小鼠体重和甲状腺素脱碘酶的影响 脱碘酶是甲状腺激素代谢中最重要的转化酶,具有催化低活性的 转变为高活性的作用,根据组织表达部位不同分为,和型脱碘酶, 在小 鼠肌肉和心肌中主要表达类型为型,在小鼠肝脏中主要表达为? 型 。为考察的敲除是否影响和在体内的暴露程度,我们 用 .方法分析甲状腺激素处理组中和小鼠的肌肉,心肌和 肝脏中的表达水平。结果图.表明和组各组织中 表达水平无显著性差异.,这说明的敲除不影响在各组织 中的表达水平。 各组小鼠经基质或处理天后,体重结果显示和组小鼠的体重 无显著性差异.图.,这说明的敲除对小鼠的体重无显著 影响作用。博士学位论文 第一章 仃弓一《一苜一。比.. 图. .法比较分析肌肉乖心肌中,及肝脏中的水平。 功 ’ ? 刁 ? \??????????????????????一???? ??????????????????一 . . 图.基质或处理天后和组小鼠的体重。 .甲状腺激素处理对心室组织中表达水平的影响 已有研究表明,甲状腺功能亢进症可显著上调在心脏中的 表达水平吲。本研究进一步用 法考察甲状腺激素处理对心室中 的蛋白表达水平的影响,以为内参,灰度分析结果表明甲状腺 激素处理可上调小鼠心室组织中的表达。博士学位论文 第一章 ?? . 工 一一一一一一 麟 . 榉瓣黼繁穆缫 竺. 《. ???????一.. 图. 分析经基质或处理后和小鼠心室中的表达水平. .心室组织中氧化应激和脂质过氧化度分析 甲亢和甲减都能影响到氧化应激水平和脂质过氧化度【,】。为考察 的敲除是否能影响心室组织中氧化应激水平和脂质过氧化度,我们通过 测定心室组织中的含量反映氧化应激水平,通过测定的含量反映脂 质过氧化程度。结果表明甲状腺激素处理可以增加心室组织的氧化应激水平和脂 质过氧化度,的敲除可以显著降低两者增加程度图.和.。 . . . . . 一?.矗芒,?工 . . ..;?. 图.基质和处理天后和小鼠心室组织中的含量. :.;?. 第一章 博士学位论文 一 ?叱《?卜、? . .;幸.,?. 图. 法分析各组心室组织中脂质过氧化程度。;幸.,?. .心室重量,厚度和心肌功能分析 基质和处理天后小鼠心脏和体重的比值结果显示图.,基质处 理组的两种基因型之间没有显著差异.,说明的敲除不影响小 鼠心脏和体重的比值,处理可以显著增加和组小鼠的心脏和体重 比 值.,而的敲除可以显著降低其增加程度.。 超生心动图结果显示图. .,对于基质处理组,和小鼠的超 生心动图参数均无显著性差异.。这说明的敲除不会显著影响 心肌的发育过程和功能。而对于处理组,小鼠的心率 ,, ,等参数均显著升高于基质处理组.,显著低于基 质处理组.,结果说明处理天后,小鼠表现出心肌肥厚和心 肌功能下降的表型。而与小鼠相比,的敲除可以显著降低诱导 引起的心率,,,等参数的升高程度.,减少 的降低程度.,这说明的敲除减轻了诱导引起的心肌肥厚 程度和心肌功能的下降程度。引起的心率速度的加快也与甲亢的 临床特征一 致。总的说来,小鼠经处理后表现出心腔扩张,心室壁厚度增大,心率 加速引,这很可能会加快心肌的耗氧,容易引起心肌的缺血和损伤,而 的敲除可减轻诱导的心肌肥厚程度,改善了心肌的泵血功能,降低引起 的心率升高,这说明心肌的机械负荷更轻,耗氧量较少,从而可能减少缺血引起博士学位论文 第一章 的心肌损伤程度。 ? ??’ ? :: . .。? ’’。。。。。。。。’ 一曩呈客皿? ?? 私?? ? . ?一一?一. 饥 幺 莒呈可墨 /一 门 . 吼 ?? 事 ’ ? 曩 弓 言?零龟二 旺 ? 各参数,包括心率,,,和。;?., 幸车. . , , ,,, 和.;宰.,?. 博士学位论文 第一章 .小鼠心脏的形态学和心肌细胞的面积分析 心脏冠状切片的染色结果图.可看出,基质处理组中和小鼠 的心脏切面上无显著差异,经处理后,两组的心脏均有不同程度 的增厚变大, 相比而言组的心脏增厚程度小于组,从心肌细胞形态学结果图. 看, 处理后组的心肌细胞肥厚程度比组更为明显,心肌细胞面积的统 计 结果图.也发现,处理后心肌细胞的平均面积显著增加.,而 组显著低于组.,这与形态学观察的结果相一致。 . : .. , 图.各组小鼠心脏冠状切片的染色的比较。刻度尺为眦。 // . , ?. 图.各组切片染色后的心肌细胞面积比较。刻度尺为 。 博士学位论文 第一章 . . 暑 盘 母 曩 母 曩. . . ‘褊附萨,,,,矿,,,, ...口口. 图.处理后、?和小鼠心室切片中心肌细胞的尺寸大小分布图, 以及各组心肌细胞 平均面积..口. . 提取质量和心肌肥厚生物标记物的测定 心肌组织中提取到的总的代表性电泳图见图.,从电泳结果可看 出 条带清晰,: 比值接近于,各样本的值/..,结果表 明心肌中提取到的总质量合格,无明显的降解。为从分子水平考 察心肌细 胞肥厚的程度,我们检测了心肌细胞肥大分子标志物脑钠肽 ,,心房钠尿因子, ,骨骼肌.肌动蛋白 ? ,.,肌球蛋白重链。实时荧光定量结 果图.表明,基质处理组中和组的各个生物标志物的表达水平无显 著性差异.,处理后的各标志物水平显著性高于基质处理组,而 处理不显著改变组的各个基因表达水平,在处理组中,各个分子标志物 在的表达水平均显著性低于,实验结果跟组织形态学的观察现象一致,以 上结果从分子水平说明的特异性敲除降低了诱导的心肌细胞肥大程 度。第一章 博士学位论文 .:. , 图.各组心室组织提取到的电泳分析典型图,其中:的比值接近于. 博士学位论文 第一章 . ? ? 广。。。。。。。。 . 皂. 守童一熏 弘 分 宝 龟望暑之 . ??’‘。。。。。’ ?? 幺 亏一一熏, 守暑一奄,差 毒 艺芷;罄《 饥 ., .,搴.;??. 图. 分析各组心室中心肌肥厚标志物? ,的表 达水平。,?.;?. .小鼠心肌纤维化程度考察 心肌纤维化伴随着心肌肥厚的发展而产生,氧化应激和重构引起的组织损伤 是纤维化的发生基础,而产生的纤维化会进一步加剧心肌的功能损伤,’ 法染色结果显示,处理后,组小鼠的心室组织内型胶原和 型胶原的表达水平显著增加.图.,切片染色结果图 .一,也显示处理后组严重的心室纤维化程度,心肌细胞肥大而边 缘模糊,组织间隙的蓝色增加表示胶原纤维的增生,组心室边缘出现的大片 第一章 博士学位论文 纤维区,可能是心外膜损伤引起的纤维化增生,而组的型胶原和?型胶原 的表达水平在处理后有增加的趋势,但是没有显著的统计学差异 .图.,切片染色图.一,也显示组较轻的组织纤维化程 度,心室边缘也出现纤维化层,但是程度上显著低于组。以上纤维化程度的 分析说明的基因敲除可减轻诱导的心室组织纤维化程度。 盈莺 ’ ., ?. . :. 图. ’ 法染色分析各组心肌组织的胶原纤维,包括基质处理的和 熏,和处理天后的和生,黑色箭头指示的蓝色表示纤维化区域, 刻度尺为。博士学位论文 第一章 ? 一 , , 卫百已一,.芝卫暑一霸暑 歪一蛋?《趸三一毒譬 : . ..;?. 图. 法较分析各组中纤维程度标志物型胶原和?型胶原的水平. .;?奉. . 的敲除对心室组织中线粒体超微结构和线粒体自噬的影响 为进一步考察的敲除是否能减轻甲状腺激素诱导后心室的线粒 体 损伤程度,我们使用电镜分析心肌线粒体的超微结构。另外因为 线粒体在生物氧 化和能量代谢过程中会产生活性氧,容易受到氧化应激的刺激而受损,细胞通过 自噬体系清理吞噬受损和突变的线粒体,然后将自噬体的等能量物 质重复利用作为新合成线粒体的原料,这样可维持线粒体的正常数量和质量,并 对线粒体基因组的稳定有重要意义瞰】。心肌组织线粒体自噬的障碍可导致心肌 肥厚和心衰等疾病【。因此我们考察各组的心肌组织中线粒体自噬的情况的变 化, 分析各组心肌组织的自噬标志物和的表达水平。 电镜观察结果表明,基质处理的组图.和组图. 中线粒体形态正常,线粒体呈球形或鹅卵石状,排列整齐有序,线粒体嵴清晰可 见,而且没有观察到明显的线粒体自噬体。对于处理的组,可观察到严 重的线粒体损伤图.,和较多的线粒体自噬体图.,,大量的线 粒体呈现肿胀变大和空泡状,线粒体嵴模糊不清,并出现断裂,自噬泡增多,出 现大量的洋葱层状,或者双层或多层膜的液泡状结构,外含溶酶 体的典型自噬线 粒体,对于处理的组也发现部分线粒体出现肿胀和轻度受损图., ,以及自噬体的出现图.,,但相比于组,线粒体的损伤程度明 博士学位论文 第一章 显较低,大多线粒体的形态正常,线粒体嵴清晰完整,自噬体的数量也较少。 诱导激酶是一种线粒体膜蛋白,有选择性清除功能受损线 粒体的作用,由于受损的粒体会泄漏,因此的表达缺失会导致氧化 应激的增加和线粒体受损引起的碎片化【】,在心肌中表达的缺失会导致心 ’】。 室功能不全和心肌组织的肥厚【 结果显示图.,基质处理和 处理组中组的心肌组织中表达水平显著高于.,经 处理后,的表达水平没有显著变化,而组的心肌组织中 是显著上调的饵.。 另外, 分析结果显示图.,处理后两种基因型心脏组织 的.的表达水平均高于基质组,对比两种基因型,结果显示处理后 的.表达水平显著低组,这与电镜观察的结果是一致的。作为连 接.和泛素化底物的一种蛋白【 ,其表达水平也侧面验证了组与. 相关的自噬程度高于组。以上结果说明,健康状态下两种基因型的线粒体形 态和自噬程度无差异,处理均可诱导和小鼠心肌组织的线粒体自噬 产生,而较高于的自噬水平可能与更多量的受损线粒体产生有关。 的敲除可降低 的表达水平,这可能是因为的敲除增加 了的表达,提高小鼠心肌组织的线粒体自噬清除的能力,降低了心肌的 氧化应激水平,从而线粒体的氧化损伤程度较轻,较少的线粒体处于自噬阶段。 的表达水平与 是相反的,这说明也介导参与心肌线粒体自噬过程。博士学位论文 第一章 ..: ?.:, ,. . . 图.电镜分析基质处理对照组中,和敲除小鼠的心肌组织超微结 构,和?处理天后,和敲除小鼠,的心肌组织超微结构,和 。 分别为,的局部放大图。刻度尺为博士学位论文 第一章 . 他 . ,. . . 图.电镜分析处理天后,和敲除小鼠,心肌组织中典型 的自噬线粒体,黑色箭头表示自噬的线粒体,和分别为,的局部放 大图。刻度尺为 。 一 一 一 一 一 一博士学位论文 第一章 ? 。。。。。。’。’? 工 。 正 《 望 厶 . , , . .图. 分析和敲除小鼠经基质或处理天后心肌组织中线 粒体自噬标志物,和,的蛋白表达水平。作为内参,用 进行灰度定量分析和.. .甲状腺激素对和敲除小鼠心肌的信号通路影响 已有研究表明,甲状腺功能亢进症可显著上调在心脏中的表达, 甲 状腺功能减退症则下调其表达【】, 这提示了在氧化应激的作用 和心功 能障碍的病因学作用。本研究使用了表现出氧化应激和线粒体功能障碍的甲状腺 功能亢进症的小鼠模型,以研究在甲状腺功能亢进症引起的心肌病中 的作用。我们建立了短期处理天和长期处理天的小鼠模型,因为 在心肌肥厚的不同发展阶段有不同的生理意义,在心肌肥 厚初期表现为激活,具有刺激心肌细胞生长和蛋白合成的作用,在心肌肥厚的后 期阶段因为伴随有心衰和心肌功能的不全,的信号降低反映了心肌细 胞的凋亡和组织坏死。 短期处理的实验结果发现图.,和组的,和 在处理后,均表现为磷酸化激活,激活程度没有差异,这说明对 的短期处理的信号