【最新word论文】去卵巢大鼠海马及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽含量的变化【临床医学专业论文】

【最新word论文】去卵巢大鼠海马及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽含量的变化【临床医学专业论文】 去卵巢大鼠海马及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽含 量的变化 作者:高飞 宋士军 胡进中 李芳芳 张若楠 【摘要】 目的 观察雌激素缺乏对大鼠海马CA1/CA2区及额叶皮层海马胆碱 能神经刺激肽(HCNP)含量的影响。方法 选取清洁级4月龄雌性SD大鼠30只， 随机分为3组:假手术组(Sham组)、去卵巢组(OVX组)和去卵巢加雌二醇(E2) 组(OVX+E2组)，每组10只。除Sham组做假性手术外，其余2组均行双侧卵巢 切除术;OVX+E2组去卵巢手术10 d后给予E2皮下注射，100 μg/kg，隔日1次。 去卵巢手术后常规喂养4个月，获取组织标本，用于组织蛋白和组织总RNA的提 取。用Western印迹法测定大鼠海马和皮层C HCNPpp、N HCNPpp的相对含量。 用RT PCR技术检测HCNPpp mRNA水平。结果 OVX组大鼠海马和皮层中C HCNPpp 的相对含量较Sham组和OVX+E2组明显升高(P,0.05)，而Sham组和OVX+E2组之 间无显著差别(P,0.05)，三组大鼠之间的海马和皮层中N HCNPpp的相对含量 差异不显著(P,0.05);OVX组和OVX+E2组大鼠HCNPpp mRNA表达与Sham组无显 著差异(P,0.05)，OVX+E2组大鼠HCNPpp mRNA表达与OVX组相比增高(P,0.05); 0.05)。结论 雌激素缺乏可导致三组大鼠皮层HCNPpp mRNA表达无显著差异(P, 大鼠海马CA1/CA2区及额叶皮层HCNP的增多。 【关键词】 去卵巢;雌激素;海马;额叶皮层;海马胆碱能神经刺激肽(HCNP) 【Abstract】 Objective To observe the effect of the defect of estrogen on the contents of HCNP in regions of CA1/CA2 of hippocampus and the expression of HCNPpp mRNA in prefrontal cortex of ovariectomized(OVX) SD rats. Methods Thirty female clean SD rats aged 4 months were randomly divided into sham, OVX, OVX and estradiol (OVX+E) groups, and ten rats per group. Sham group was ablated some adipose tissue above ovaries, OVX group was ablated two sides ovaries, OVX+E group was supplied by estradiol (100 μg/kg, qod) after 10 d of ovariectomy. Postoperative rats were fed by routine method and then sacrificed 4 months later to obtain tissues and specimen for the use of the extraction of tissues’ protein and total RNA.The relative protein contents of C HCNPpp and N HCNPpp were measured by Western blotting, and the expression of HCNPpp mRNA was measured by RT PCR in the dorsal hippocampus and prefrontal cortex of ovariectomized rats. Results Compared with that of sham group and OVX+E group,the relative content of C HCNPpp of OVX group in hippocampus and prefrontal cortex was higher, and there was not different between sham group and OVX+E group (P>0.05). However，the expression of N HCNPpp in hippocampus and prefrontal cortex was not different among three groups (P>0.05) .Compared with that of sham group, the relative expression of HCNPpp of OVX group and OVX+E group in hippocampus was not 1 different(P>0.05).Compared with that of OVX group, the relative expression of HCNPpp mRNA of OVX+E group in hippocampus was higher (P ,0.05). The relative expression of HCNPpp mRNA in prefrontal cortex was no different among three groups (P>0.05). Conclusions The deficiency of estrogen in female rats leads to the increasing of the relative amount of HCNP in CA1/CA2 of hippocampus and prefrontal cortex of ovariectomized rats. 【Key words】 Ovariectomy; Estrogen; Hippocampus; HCNP 绝经前妇女AD发病率远远低于同龄男性，而在绝经后妇女，AD的发病率迅 速上升，甚至超过男性。然而，在激素替代治疗(HRT)的妇女，AD的发病率呈 下降趋势，这提示雌激素可能具有保护神经细胞和防止神经退变的作用，因此， 雌激素水平的降低是AD的诱发因素之一〔1〕。基于此，本研究以去卵巢大鼠为研 究对象，观察雌激素缺乏对海马CA1/CA2区、额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽前 体蛋白(HCNPpp)/海马胆碱能神经刺激肽(HCNP)的影响，探讨它们之间的相互 关系，以便进一步理解雌激素对中枢神经系统某些分子表达的调控作用，以及雌 激素缺乏时可能诱发AD发生、发展的分子基础。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1 动物模型制备及分组 3月龄清洁级雌性SD大鼠30只(河北医科大学 实验动物中心，动物合格证 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 编号:611120)。普通大鼠饲料喂养(河北医科大学 实验动物中心)。常规饲养一个月后，将大鼠随机分为3 组:假手术组(Sham组)、 去卵巢组(OVX组)和去卵巢给予雌二醇(E2)组(OVX+E2组)，每组10只。应用戊 巴比妥钠(36 mg/kg)对3组大鼠行腹腔内麻醉，取俯卧位，选取大鼠髂前上棘靠 头部约1.5,2.0 cm，脊柱旁开约2.0 cm处，常规剪毛消毒、切开皮肤、分离肌 肉、切开腹膜，OVX组及OVX+E2组行双侧卵巢切除术。Sham组行同样手术程序， 仅切除少量脂肪组织(体积同卵巢大小)。术后大鼠用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 饲料喂养，自由 进食饮水;OVX+E2组于去卵巢手术2 w后给予E2皮下注射，100 μg?kg-1?2 d-1， 术后常规喂养4个月。 1.2 药品与试剂 E2(天津金耀氨基酸有限公司);苯甲基磺酰氟(PMSF)(北 京鼎国生物技术有限责任公司);亮抑酶肽(leupeptin)(北京拜尔迪生物公司); Bradford蛋白定量试剂盒(北京奥森生物公司);预染低分子量蛋白Marker(北 京普利莱生物公司);PVDF膜(0.2 μm)(美国Milipore公司);HCNPpp氨基末端 抗体(N HCNPpp Ab)、HCNPpp羧基末端抗体(C HCNPpp Ab)、β actin抗 体、免疫印迹发光染料(ECL)(美国Santa Cruz公司);辣根过氧化物酶标记兔抗 山羊IgG和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥公司);β 巯基 乙醇(美国Promega公司);Taq DNA聚合酶(美国Fermentas公司);dNTP(北 京鼎国生物公司);反转录试剂盒(美国Fermentas公司);HCNPpp mRNA、β actin引物(上海生工公司)。其余试剂均为国产优级纯或 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯。 1.3 仪器设备 DYY ?型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);20PR 52D 2 型低温高速离心机(日本日立公司);PTC 200型PCR热循环仪(美国MJ Research);JEDA801E 型捷达凝胶成像仪(江苏捷达软件公司)。 1.4 组织标本的采取及指标测定 用戊巴比妥钠(36 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，剪开头皮，用止血钳沿大鼠头颅中央骨缝撬开，迅速分离脑组织，剥取海马，同时刮除腹侧齿状回和CA3区，剥取额叶皮层，立即将海马背侧组织(CA1/CA2)及额叶皮层置液氮中，于 -80?低温冰箱保存，用于组织蛋白和组织mRNA的提取。分离大鼠子宫并进行称重。 1.5 组织蛋白的提取 取大鼠海马背侧组织及额叶皮层各约50 mg，加入预冷的蛋白匀浆液0.5 ml，在冰浴中匀浆5 min，4? 离心10 000 r/min离心30 min，取上清，Bradford法测定蛋白含量。 1.6 HCNP pp蛋白的测定 采用Western印迹方法。总蛋白提取和定量后，按25 μg/孔计算样品的上样量，进行12% SDS PAGE，冰水浴转膜，恒压100 V，1 h 45 min。取膜TBS冲洗。用TBS配制5%脱脂奶粉，室温封闭4 h。用5% 的BSA按比例稀释一抗(C HCNPpp 1?1 500;N HCNPpp 1?1 500;β actin 1?2 000)，向膜的正面滴加一抗，4? 过夜(防止液体蒸发)。回收一抗后，用0.05% Tween PBS漂洗液振摇漂洗3次，每次10 min。用5%的BSA按1?6 000稀释二抗，滴加二抗，室温静置2 h。用0.05% Tween TBS漂洗液振摇漂洗3次，每次10 min，最后用TBS洗膜5 min，在暗室滴加ECL试剂反应3 min，保鲜膜包裹置于暗盒中进行X光胶片曝光、显影和定影。用凝胶成像分析仪采集图像并用软件进行分析。β actin作为内参照。 1.7 HCNP mRNA表达的测定 用Trizol法提取总RNA。将含1.0 μg RNA的水溶液和随机引物置于0.2 ml的微量离心管中，70?变性5 min，立即置于冰水浴中。加入反应体系中的其他成分混匀，25? 15 min，42?孵育60 min，70? 10 min，置冰水浴冷却，得到cDNA，-20?保存备用。PCR引物序列如下:HCNPpp(基因文库:NM_017236):上游:5′ ACTACGGCGGAGTAACGG 3′，下游:5′ GCTTGGGCACAGAGTCATC 3′，长度456 bp;β actin(基因文库:NM_031144):上游:5′ GCCATGTACGTAGCCATCCA 3′，下游:5′ GAACCGCTCATTGCCGATAG 3′，长度375 bp。HCNPpp、β actin基因扩增条件均为94? 2 min;94? 45 s;56? 45 s;72? 60 s;72? 5 min，循环28次。取HCNPpp和β actin PCR产物各5 μl，用2% 琼脂糖凝胶进行电泳，将结果用凝胶成像系统照相，分析扩增产物的积分光密度值(I)，计算二者的比值(IHCNPpp/Iβ actin)，作为HCNPpp的相对表达量。 1.8 统计学处理 数据以x?s表示，采用SPSS13.0软件进行正态性及方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析。 2 结 果 2.1 大鼠子宫重量 与Sham组〔(0.86?0.06)g〕相比，OVX组大鼠子宫重量〔(0.14?0.04)g〕明显降低(P,0.01);与OVX组比较，OVX+E2组〔(0.78?0.03)g〕显著升高(P,0.01);而Sham组与OVX+E2组无显著差异。 3 2.2 大鼠海马HCNPpp相对含量 与Sham组相比，OVX组C HCNPpp的相对含量明显升高(P,0.05);与OVX组比较，OVX+E2组显著降低(P,0.05);而Sham组与OVX+E2组之间无显著差异(P,0.05)。3组间N HCNPpp相对含量无显著差异，见图1、表1。 图1 大鼠海马和皮层HCNPpp相对含量 2.3 大鼠皮层HCNPpp相对含量 与Sham组相比，OVX组C HCNPpp的相对含量明显升高(P,0.05);与OVX组比较，OVX+E2组显著降低(P,0.05);而Sham组与OVX+E2组之间无显著差异(P,0.05)。3组间N HCNPpp相对含量无显著差异，见图1、表1。 2.4 大鼠海马HCNPpp mRNA表达 与Sham组比较，OVX组和OVX+E2组HCNPpp mRNA表达无显著差异(P,0.05);与OVX组比较，OVX+E2组HCNPpp mRNA表达显著升高(P,0.05)，见图2、表1。 2.5 大鼠皮层HCNPpp mRNA表达水平的变化 Sham组、OVX组和OVX+E2组之间的HCNPpp mRNA表达无显著差异(P,0.05)，见图2、表1。表1 三组大鼠海马和皮层HCNPpp及HCNPpp mRNA的表达 3 讨 论 在中枢神经系统，HCNPpp的N端可被巯基酶水解释放出11肽的产物，称为HCNP，具有中枢胆碱能神经刺激活性，HCNP可以单独或与神经生长因子协同来提高中枢胆碱能神经胆碱乙酰基转移酶的表达和酶活性，进而促进脑内胆碱能神经元发育〔2〕。AD 患者尸检发现，HCNP在平野小体积聚和强表达，导致海马胆碱能系统的损害。另外，高水平的HCNP还在AD初期病人的脑脊液中被发现〔3〕。在明显表现痴呆症状的快速老化小鼠SAMP8的海马，HCNPpp mRNA的表达水平增加，转基因Tg2576小鼠和临床AD病人的脑切片显示，在老年斑局部周围，HCNPpp的表达增多〔4，5〕。敲除小鼠HCNPpp基因，小鼠表现出明显的嗅觉缺失，而这与AD的早期症状相吻合〔6〕。种种迹象表明，HCNPpp及其产物HCNP在AD的病理过程中可能具有重要作用。 HCNP是由11个氨基酸残基构成的多肽，因不具有抗原性而不易测定，因而本研究选择了两种抗体，它们分别是针对N HCNPpp和C HCNPpp，这两种抗体检测结果的意义不同。用N HCNPpp抗体测定，其结果显示的是HCNPpp(23 kD)的变化;而用C HCNPpp抗体测定，其结果显示的是HCNPpp(23 kD)和HCNPpp羧基末端降解产物(22 kD)的总和，这一结果也间接表示了HCNP含量的变化。当HCNPpp含量不变，而HCNPpp和HCNPpp羧基末端降解产物总量增加时，实际上表明了HCNP的增多。选择两种抗体有双重含义:第一，测定HCNPpp有无变化;第二，测定HCNP有无变化。这两种化学成分都具有重要的生物学作用。本结果显示，在去卵巢大鼠额叶皮层与海马CA1/CA2区，HCNP明显升高，而HCNPpp水平则无明显变化，说明，雌激素确实可直接或间接调控与AD相关的基因的表达，雌激素缺乏可导致HCNP含量的增多。因此推测，在绝经后的妇女，由于雌激素缺乏 4 可最终导致海马和大脑皮层HCNP增多，继而触发AD的病理过程，最终导致AD 的发生和发展。 【参考文献】 1 Bonnie JD，Kenneth SK.Estrogen receptor and human disease〔J〕.J clinical investigation,2006;116(3):561 70. 2 Ojika K，Mitake S，Appel SH,et al.Hippocampal cholinergic neurostimulating peptides (HCNP)〔J〕.Prog Neurobiol,2000;60(1):37 83. 3 Tsugu Y，Ojika K，Matsukawa N,et al.High levels of hippocampal cholinergic neurostimulating peptide (HCNP) in the CSF of some patients with Alzheimer′s disease〔J〕.Eur J Neurol，1998;5(6):561 69. 4 Matsukawa N，Tooyama I，Kimura H,et al.Increased expression of hippocampal cholinergic neurostimulating peptide related components and their messenger RNAs in the hippochampus of aged senescence accelerated mice〔J〕.Neuroscience,1999;88(1):79 92. 5 George AJ，Holsinger RM，Mclean CA,et al.Decreased phosphatidylethanolamine binding protein expression correlates with A beta accumulation in the Tg2576 mouse model of Alzheimer′s disease 〔J〕.Neurobiol Aging，2006;27(4):614 23. 6 Theroux S，Pereira M，Casten KS,et al.Raf kinase inhibitory protein knockout mice:expression in the brain and olfaction deficit〔J〕.Brain Res Bull，2007;71:559 67. 5