第五章植物细胞培养技术第一节植物单细胞的分离一、由植物器官分离单细胞（一）机械法（二）酶解法两种方法的优缺点。二、由愈伤组织分离单细胞第二节单细胞培养技术一、植物单细胞培养的意义1、建立单细胞无性系。2、排除体细胞的干扰，有利于对细胞活动的观察。3、增加了无性繁殖的范围和潜力，提高了繁殖速度。4、许多杂合的重要经济植物通常是以无性方式繁殖-植物细胞培养。5、植物细胞培养在生物科学研究及提供医药产品等方面也有着广阔的情景。二、单细胞培养的方法（一）液体浅层培养（概念及其优缺点）（二）微室培养（微滴培养）（40-100µl）概念、用途、优缺点、要求（三）平板培养（图5-2）概念、优缺点（四）看护培养（图5-3）概念、用途、基本技术、要求、优缺点三、影响单细胞培养的因素1、植物因素2、培养基成分3、培养方式4、初始细胞植板密度（>临界密度）5、生长激素6、pH7、CO2四、细胞培养注意事项1、实验前准备工作。2、保持气流通畅、操作规范。3、无菌操作。4、安全防护。5、设备维护。6、清场工作。第三节植物细胞悬浮培养植物细胞悬浮培养：将离体的植物或小的细胞团置于液体培养基中进行培养和生长的一种技术。一、细胞悬浮培养原理良好细胞悬浮培养应具备的三大特征。悬浮培养的两个基本特点悬浮培养的目的（生产次生代谢产物）二、培养方法（一）植物细胞悬浮培养的8大特性（二）植物细胞悬浮培养需要解决的6大问题（三）悬浮培养系统1、分批式培养（3个特点）2、流加式培养（4个特点，营养成分及其分类）3、半连续式培养（4个特点）4、连续式培养（优点，缺点及特点）5、灌流式培养三、悬浮系的建立与继代培养（一）悬浮系的制备成功悬浮细胞培养体系必须满足的三个条件（二）继代培养1.继代培养的方法和最佳时机2.细胞生长曲线（图5-5细胞的生长周期曲线）3.五个时期的特点讨论及注意事项四、悬浮培养细胞的同步化（一）物理方法1、分选法2、冷处理法（二）化学方法1、饥饿法2、抑制剂法3、有丝分裂阻抑五、细胞增殖的测定（一）细胞计数法（二）细胞密实体积（PCV）（三）细胞生物量计算法1、直接称量2、干重法（四）植板率（五）细胞大小测量六、培养细胞活力的检查1、酚藏花红溶液染色法2、相差显微术法（胞质环流法）3、TTC法4、FDA染色法5、伊凡蓝法6、细胞再生能力的鉴定第四节植物细胞的规模培养一、概述（一）植物细胞培养意义（4个）（二）植物细胞培养的优势（三）规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径1、保护生态环境2、提高生产效率3、发展新型生物技术产业（生物制药）二、植物细胞规模化培养体系的建立（一）植物细胞大规模培养的技术要求（1、培养的细胞在遗传上是稳定的，以得到产量恒定的产物。2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量终产物。3、代谢产物要在细胞内积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。（二）植物细胞规模培养技术3个要点1、细胞系的建立和选择2、优良细胞系的增殖培养3、大规模培养体系的建立（一步法逐级放大、两步法、固相培养-两步法）（三）培养方式的选择1、悬浮细胞培养2、固定化细胞培养（常用的固定化方法、固定化培养实例、植物细胞自生固定化）三、生物反应器类型及特点（一）植物细胞悬浮培养生物反应器主要类型及其特点（优缺点，图5-6）1、搅拌式生物反应器2、气泡柱式反应器3、气升式反应器（二）固定化植物细胞反应器1、固定化细胞同悬浮细胞的优点有利于次级代谢产物的积累细胞经包埋后，可以减小剪切力的损伤，有利于产物的合成和分泌有利有进行连续培养和生物转化平床培养体系和立柱培养体系（图5-7.5-8）植物组织、细胞培养方式及特点（表5-4）四、植物细胞规模化培养中的有关
工程
路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理
技术问题（5点）第五节植物细胞培养的应用一、筛选突变体（一）植物细胞培养与突变体筛选1、诱变剂的选择（物理/化学诱变）2、诱变材料的选择（二）突变体的类型（三）突变体的筛选方法正选择系统、负选择系统，“绿岛法”选择法二、生产植物次生代谢产物植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所需的小分子化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。此生产物在植物中的合成与分解过程称之为次生代谢。（一）植物次生代谢产物的种类（根据分子结构的不同大致分为10类，从天然物质中提取的方式受到挑战，其原因有4点）（二）利用植物细胞培养生产次生代谢产物与利用栽培植物相比所具备的5大优点（三）影响植物组织、细胞培养生产次生代谢产物的因素内因：（细胞的遗传特性&母细胞外植体生理状态）外因：1、外植体的选择2、高产细胞系的选择3、基本培养基的筛选4、培养条件（四）提高细胞此生代谢产物的途径1、明确植物细胞生长与产物合成的关系（生长偶联型、中间型、非生长偶联型）2、选择适宜的起始材料3、选择合适的培养基成分（N,P,K,糖的浓度）4、激发因子的应用（非生物激发因子，生物激发因子）5、培养技术的选择（液-液系统，液-固系统）（五）植物次生代谢物的分离纯化1、提取方法溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、微波提取法、超声波提取法等。2、分离和精制方法系统溶剂提取法、两相溶剂萃取法、沉淀法、盐析法、透析法、分馏法、结晶法、层析法等。高效液相色谱，紫外光谱，红外光谱。色谱仪，质谱仪。
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