一、实验目的了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。实验二原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）组织培养细胞上皮细胞成纤维细胞slidesfromCDC上皮细胞(epithelialcells–adenovirus)uninfectedearlyinfectionlateinfectionslidesfromCDCepithelialcells-respiratorysyncytialvirusuninfectedrespiratorysyncytialvirusslidesfromCDC成纤维细胞-herpessimplexvirusuninfectedearlyinfectionlateinfectionslidesfromCDC成纤维细胞-poliovirusuninfectedearlyinfectionlateinfectionslidesfromCDC应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个或数个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常可使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长增殖。二、原理三、材料1、9-10日龄鸡胚2、照蛋灯与蛋座3、碘酊棉球与酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小镊子5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶6、0.25%胰酶、DMEM培养液生长液：含10%犊牛血清的DMEM培养液维持液：含5%犊牛血清的DMEM培养液四、细胞培养的条件要求1）细胞密度原代细胞：4-6×105个/ml传代细胞：2-3×105个/ml2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。五、胰酶的作用机制1、血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清2、血清的处理无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。六、血清3、血清的作用提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子补充基础培养液中没有或量不足的营养成分促进细胞贴壁提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等中和毒性物质良好的缓冲系统提供蛋白酶抑制剂4、应用血清存在的问题血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定，影响对结果的
分析
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。七、操作
步骤
新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤
取胚（1，2）剪胚（3，4）消化（5，6，7，8）分散培养（9，10）1．取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。2．无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。取胚3．用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。4．将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。剪胚5．将剪碎的组织块倒入大青霉素瓶中，加入5mlDMEM，振摇后静置几分钟，吸弃洗液；如此重复1次。6.加5ml胰酶，在37℃水浴中消化20-30min，5~8分钟摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即
表
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示消化足够）。消化7．消化好后，取出瓶子，静置几分钟，吸弃胰蛋白酶液。8.加DMEM生长液5ml，轻轻摇动几次后，静置几分钟吸去。如此重复一次（目的是洗去残余的胰蛋白酶和抑制其消化作用）。消化9．加入生长液5ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置3~5分钟，使未消化好的组织块下沉。10．轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每瓶约1-2ml，补加DMEM生长液至10ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。分散培养11.细胞计数方法取细胞悬液0.5ml+2ml0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。八、实验结果（鸡胚成纤维细胞）
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