专题53血红蛋白的提取与分离

课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 3血红蛋白的提取和分离(一）蛋白质占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物2、组成元素C、H、O、N一、基础知识1、含量3、相对分子质量高分子化合物4、基本组成单位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸连接方式脱水缩合8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（一条或者多条）10、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9、蛋白质结构的多样性①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成n-m个肽键,脱去个n-m个水分子，至有氨基和羧基各m个11、相关计算③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构④关于蛋白质相对分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为n·a-(n-m)·181、分离生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2、蛋白质分离和提取的原理根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质(二）蛋白质的提取3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、空间结构4、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白（三）凝胶色谱法②实例：葡聚糖、琼脂糖3、凝胶1、别名：分配色谱法①性质：一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离①大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道4、凝胶色谱法的原理—分子筛效应③分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离②当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢5、具体过程蛋白质分子量的大小4、依据的特性（四）缓冲溶液1、概念在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变2、作用4、缓冲溶液的组分分类①弱酸和弱酸盐组合H2CO3NaHCO3CH3COOHCH3COONa3、缓冲溶液的配制通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液②弱碱和弱碱盐NH3H2ONH4CL③多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐NaH2PO4Na2HPO4KH2PO4K2HPO4思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)（五）电泳：1、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2、原理②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离3、类型琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳4、实例由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量①应用②聚丙稀酰胺凝胶蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素③原理④SDS作用为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDSSDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小⑤SDS作用机理讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售.二、实验操作样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定1、样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤(1)血液组成（二）操作过程血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个a－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团①成分每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色②组成及作用本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白③选材①阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？红细胞3g柠檬酸钠血液100mL低速离心2min红细胞血浆吸出血浆5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色(2)红细胞的洗涤②洗涤操作(3)释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ？目的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ：蒸馏水的作用是_________________________。加入甲苯的作用是_______________________。充分搅拌的目的是_______________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂滤纸过滤脂类物质(4).分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体③分离第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）②试管中溶液层次20mmol/L磷酸缓冲液﹙5﹚透析血红蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时二.纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱（1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底注意事项：⑤安装其他附属结构③顶塞的制作打孔安装玻璃管④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-7520mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择A、材料“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克B、代表意义：交联葡聚糖凝胶（G-75）配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法A、固定B、装填将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀注意：2、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果注意：2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时④洗涤平衡3.样品的加入和洗脱1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱5.收集缓冲液凝胶注意：正确的加样操作1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。讨论：答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2、试剂的配制①丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺:用去离子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液②十二烷基硫酸钠（SDS）:用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存鉴定血红蛋白纯度1、目的③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液④TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合⑤用去离子水配制10%过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液 25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS⑦样品处理液 50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油⑨脱色液 10%的甲醇和10%的冰醋酸⑧染色液 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行注意事项：2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命3、在进行电泳操作时一定按照实验 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 和步骤完成。操作时要戴好一次性手套①SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备用去离子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris缓冲液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3mm），以阻止氧气进入凝胶溶液3、电泳方法步骤用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris缓冲液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合②分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水（3）样品处理　③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液（5）加样在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100℃温度下加热3min，以使蛋白质变性按顺序加样，加样量通常为10—25μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品（4）浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm处，关闭电源（6）电泳（7）剥胶从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位（8）染色将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2h染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10h，其间需多次更换脱色液至背景清楚（9）脱色（10）观察结果SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？知识总结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A调节pHB维持红细胞的能量供应C防止微生物生长D防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的O2分子数或者CO2分子数分别是A4、2B4、4C2、1D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀