苯酚5mmol/L实验十四血清胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）胆固醇的测定方法很多；通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法五大类。化学试剂比色法中有直接法和间接法;前者可用血清直接测定,后者是用溶剂或其它方法提取胆固醇后再作定量。酶法由于操作简便、结果准确试剂无腐蚀性，而且因使用特异性酶,大大减少了血液中其它成分的干扰,目前已成为测定胆固醇的主要方法.【目的】1．了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理,能进行血清胆固醇测定的操作。2。掌握血清胆固醇测定的临床意义。【原理】血清中总胆固醇（TC）包括胆固醇酯（CE）和游离型胆固醇（FC）,酯型占70%,游离型占30%。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA）,胆固醇在胆固醇氧化酶（C0D）的作用下氧化生成A—胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化氢与4-氨基安替比林（4—AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500nm波长处测定吸光度，与
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管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：胆固醇酯——CEH—一胆固醇+脂肪酸胆固醇＋O2——C°D-^4-胆甾烯酮+H2O22只2。2+4-氨基安替比林+酚——POD_—红色醌亚胺【器材】试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计.【试剂】酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒。1。酶应用液胆固醇酶试剂的组成为：pH6。7磷酸盐缓冲液胆固醇酯酶胆固醇氧化酶过氧化物酶4—氨基安替比林50mmol/L三200U/L三100U/L三3000U/L0。3mmol/L此外还含有胆酸钠和TritonX—100,胆酸钠是胆固醇酯酶的激活剂，
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面活性剂TritonXT00能促进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯，有利于胆固醇酯的水解。5。17mmol/L(200mg/dl)胆固醇标准液精确称取胆固醇200mg溶于无水乙醇，移入100ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度(也可用异丙醇等配制)。【操作】取试管3支，编号，按下操作。表3-15酶法测定血清胆固醇操作
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加入物(ml)测定管标准管空白管血清0。02－－胆固醇标准液－0。02－蒸馏水－－0。02酶应用液2。002。002.00混匀后，37°C水浴保温15分钟，在500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。【计算】测定管吸光度、/血清胆固醇(mmol/L)=X5.17标准管吸光度【注意事项】1。黄疸血清过高的胆红素可还原一部分反应中的h2O2，降低显色反应，使结果偏低。但测定胆固醇，胆红素对酶法的干扰比化学法小。2。用胆固醇标准液引起的误差较大，故目前提倡采用胆固醇定值血清为标准。3。轻度溶血对测定结果无影响，但明显溶血可使结果增高，此时可用一个不加COD的空白管从结果中减去后纠正。4。其它影响因素，如维生素C、谷胱甘肽、氟化物引起负偏差。【正常参考范围】3。10〜5。70mmol/L【临床意义】1。血清胆固醇增高常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症、糖尿病、肾病综合征、胆管阻塞、甲状腺功能减退。2。血清胆固醇降低常见严重贫血、甲状腺功能亢进、长期营养不良等。【结果及
分析
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】【思考题】1．胆固醇有哪些重要的生理功能，血清胆固醇升高对机体最严重的危害是什么？2．胆固醇在体内可转变为哪些物质，如何排泄？3．实验中需要哪几种酶参加,各有什么作用？
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