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欧盟消毒液实验测试方法EN 1276 translated -

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欧盟消毒液实验测试方法EN 1276 translated -EN 1276-2010 食品业,工业,家用和公共场所设备中测定化学消毒剂和防腐剂的杀菌作用的定量悬浮液试验.检验方法和要求(第2阶段/1级) 前言: 该欧洲标准主要介绍了一种定量悬浮测试的方法,用于评价在本标准第1条中描述应用领域中化学消毒剂或皮肤粘膜消毒剂是否具有杀细菌活力。 实验室测试非常近似的模拟了产品实际的应用条件。所选择的测试条件(接触时间、温度、微生物)都反映出了实际使用条件下的一些情况,包括可能的影响消毒剂效力的因素。 这些实验条件试图涵盖普通的应用领域并且希望能在实验室和各种产品类型之间...

欧盟消毒液实验测试方法EN 1276 translated -
EN 1276-2010 食品业,工业,家用和公共场所设备中测定化学消毒剂和防腐剂的杀菌作用的定量悬浮液试验.检验方法和要求(第2阶段/1级) 前言: 该欧洲 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 主要介绍了一种定量悬浮测试的方法,用于评价在本标准第1条中描述应用领域中化学消毒剂或皮肤粘膜消毒剂是否具有杀细菌活力。 实验室测试非常近似的模拟了产品实际的应用条件。所选择的测试条件(接触时间、温度、微生物)都反映出了实际使用条件下的一些情况,包括可能的影响消毒剂效力的因素。 这些实验条件试图涵盖普通的应用领域并且希望能在实验室和各种产品类型之间互作参考。本实验中每种使用浓度都对应了明确的实验条件。尽管如此,对于一些应用领域,产品对应的使用建议可能不同,因此需要更多的测试条件。 1 范围: 本欧洲标准详细描述了该测试方法以及测试化学消毒剂杀细菌活力测试的最低实验要求。这些化学消毒剂可以经硬水稀释形成外观均一稳定的体系(对于直接使用的产品则使用纯水稀释)。由于测试时需要加入微生物悬液和干扰物质,这些产品测试时的浓度均不高于80%。 本标准适用的产品应用于除了活体消毒(手消毒除外)和医院范围以外的食品,工业,家庭和公共机构等领域。 本方法的应用范围至少包含以下方面: A) 以下相关的生产过程、分装和零售: 1) 动物来源的食品: · 奶和奶制品 · 肉和肉制品 · 鱼、海鲜及其制品 · 蛋和蛋制品 · 动物饲料 · 其他 2) 植物来源的食品: · 饮料 · 水果、蔬菜及其衍生品(包括制糖和酿酒) · 面粉 · 动物饲料 · 其他 B) 机构和家庭领域: · 餐饮单位 · 公共区域 · 公共交通 · 学校 · 幼儿园 · 商店 · 健身房 · 垃圾站 · 宾馆 · 家庭住所 · 医院临床非敏感区域 · 办公室 · 其他 C) 其他工业领域: · 包装材料 · 生物工程(酵母、蛋白、酶等) · 制药 · 化妆品和洗漱用品 · 纺织 · 空间行业、电脑行业 · 其他 注: 该方法用于评价商业化配方产品或活性物在其使用条件下的杀菌活力。 2 参考标准 EN12353,化学消毒剂和皮肤粘膜消毒剂-杀菌活性测定用微生物株的保存 EN14885:2006,化学消毒剂和防腐剂-化学消毒剂和防腐剂欧洲标准的应用 3 术语和定义 参见EN14885:2006 4 实验条件 4.1 表面杀细菌活力实验要求 产品经硬水稀释(对于直接使用的产品则使用纯水稀释)后按照本方法第5条,根据实际应用情况分别在模拟的清洁环境(0.3g/L牛白蛋白和1g/L蛋白胨,参见3.6节)和污染环境(3g/L牛白蛋白和1g/L蛋白胨,参见3.7节)进行测试,同时满足其他必须测试的条件下(四种微生物,20℃,5分钟或1分钟(手消毒)),需要获得活菌数量至少5个数量级减少的效果。 杀细菌活力需要经过如下四种菌的评价:铜绿假单胞菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和兼性肠球菌。 对于特定用途,需要测试产品在其他的接触时间,温度,干扰物质和评价菌种等情况下的杀细菌活力。 注: 通过其他的测试条件决定的有效浓度可能会低于通过上述标准条件下得到的浓度值。 5 测试方法 5.1 原理 5.1.1 将样品或其硬水稀释液(对于直接使用的产品,使用纯水稀释)加入到含有干扰物质的特定的菌悬液中,混合液在20±1℃条件下放置5min±10s(常规测试条件)或者1min±10s(手消毒产品常规测试条件)。混合时间结束后,快速将整数量(1ml)的混合液转移至已经验证过的中和剂中以消除消毒剂的杀菌活力。该方法为稀释中和法。如果没有合适的中和剂,则使用膜过滤的方法。检测每种样品存活细菌的数目,计算出细菌的减少量。 5.1.2 本测试使用的菌种为铜绿假单胞菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和兼性肠球菌 5.1.3 额外的接触时间和测试温度均可根据需要进行选择。也可以使用额外的测试菌种。 5.2 材料和试剂 5.2.1 测试菌种 杀细菌活力测试需使用以下四种菌进行测试: --- 铜绿假单胞菌 ATCC 15442 --- 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 --- 兼性肠球菌 ATCC 10541 --- 大肠杆菌 ATCC 10536 如果特定应用方面需要,可以选择额外的菌种,比如: --- 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 13311 --- 短乳杆菌 DSM 6235 --- 阴沟肠杆菌 DSM 6234 上述细菌需要的培养温度为(36±1)℃或者(37±1)℃。在所有的测试、培养和验证环节均需要使用同样的培养温度。 如果使用以上额外的菌种,需要在最佳的生长条件下(温度,时间,空气等)进行培养,并且在测试报告中注明。 如果额外使用的菌种不在上述菌种内,则需要验证这些菌接种物的浓度是否足够。如果额外菌并没有在参考菌种库中进行分类,则需要给出这类菌的鉴定结果。另外,这些菌需要在测试实验室或则国家菌种保存机构保存五年。 5.2.2 培养基和试剂 5.2.2.1 综述 本标准中所有化学物质的重量均为无水盐,水合物可以使用,但在计算重量是需要根据其水合比例进行换算。 所有试剂都必须是分析级的并且适合微生物实验使用的,不含对微生物有毒害或抑制作用的成分。 注: 为了提高结果的重复性,建议使用商品化的干粉培养基来制备培养基,并且严格遵守生产商的使用说明。 5.2.2.2 水 最好是新鲜的蒸馏水而不是去离子水。 高压蒸汽灭菌(参见5.3.2.1) 注1:如果水是同试剂一起灭菌,则不需要单独进行灭菌。 注2:如果没有质量合格的蒸馏水,则可使用注射用水。 5.2.2.3胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA) 胰蛋白胨 15.0g 大豆蛋白胨 5.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g 水 1000ml 高压蒸汽灭菌。灭菌后培养基的pH值(20℃测试)应在7.2±0.2。 注: 如遇到需要中和剂的情况,可以将其加入TSA培养基中(参见附录B) 5.2.2.4 稀释液 蛋白胨氯化钠溶液: 胰蛋白胨 1.0g 氯化钠 8.5g 水 1000ml 高压蒸汽灭菌。灭菌后培养基的pH值(20℃测试)应在7.0±0.2。 5.2.2.5 中和剂 中和剂效力验证根据本标准5.5.1.2,5.5.1.3和 5.5.2节 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 。中和剂必需是无菌的。 注:对于一些产品现在已知的一些中和剂信息,列于附录B。 5.2.2.6 冲洗液(用于膜过滤) 冲洗液需根据本标准5.5.1.2,5.5.1.3和 5.5.2节规定进行验证。冲洗液必需是无菌的,并且在本标准5.5.3规定的测试条件下与滤膜有很好的相容性和通过性。 注: 适用于现有产品的冲洗剂信息可参考附录B。 5.2.2.7 硬水(用于稀释产品) 按如下方法配制: --- 溶液A: 19.84g无水氯化镁和46.24g无水氯化钙溶于水中,稀释到1000ml。高压蒸汽灭菌或者膜过滤除菌。如果使用高温高压灭菌,则在无菌条件下将因高温灭菌造成的水分损失补回到1000ml。该溶液在4-8℃冰箱中最多保存一个月 --- 溶液B: 35.02g碳酸氢钠溶解在水中,稀释到1000ml。膜过滤除菌,该溶液在4-8℃冰箱中最多保存一个星期。 加入600ml水至1000ml容量瓶中,加入6.0ml溶液A,8.0ml溶液B,稀释至1000ml。配制好的硬水的pH值至7.0±0.2(20±1℃测试)。如有需要,用40g/l的NaOH溶液或者36.5g/l的HCl溶液调节其pH值。 硬水需要无菌条件下新鲜配制并在12小时内使用完毕。 注:当制备待测产品的三个不同浓度溶液时(参见5.4.3),加入产品到硬水中会导致水硬度的变化。在任何情况下测试样品中的最终硬度均低于300mg/kg CaCO3。 5.2.2.8 干扰物质 5.2.2.8.1 综述 干扰物质需要根据产品使用环境进行选择。 干扰物质需要是无菌的并且配制成10倍于测试时的最终浓度。 干扰物质的离子组成(pH,钙/镁硬度)和化学组成(矿物质,蛋白质,碳水化合物,脂类和清洁剂等)均需要全部定量。 5.2.2.8.2 清洁环境(低浓度牛白蛋白溶液) 0.3g牛白蛋白溶解于水中,配制成100ml溶液,过滤除菌,保存于冰箱中一个月内使用。 最终测试时(参见5.5)的牛白蛋白浓度为0.3g/L 5.2.2.8.3 污染环境(高浓度牛白蛋白溶液) 3.0g牛白蛋白溶解于水中,配制成100ml溶液,过滤除菌,保存于冰箱中一个月内使用。 最终测试时(参见5.5)的牛白蛋白浓度为3g/L 5.2.2.8.4 牛奶(牛奶工业) 脱脂奶粉,确保无抗生素和添加剂,将100g溶解于1000ml水中,制成复原乳。在105±3℃下高压蒸汽灭菌30分钟(或在121±3℃下灭菌5分钟)。 最终测试时的复原乳浓度为10.0g/l。 5.2.2.8.4 酵母浸出物(啤酒工业) 细菌学脱水酵母浸出粉,按如下方法配制: --- 配制100g/l的溶液,用氢氧化钠调节pH至7.0±0.2 --- 高压蒸汽灭菌 最终测试时的酵母浸出物浓度为10g/l 5.2.2.8.5 蔗糖(饮料工业) 配制100g/l的蔗糖溶液,膜过滤除菌。最终测试时的蔗糖浓度为10g/l。 5.2.2.8.6 pH5.0 和pH9.0 缓冲溶液(原位清洗) 缓冲溶液的成分和pH值需要在测试报告中注明。测试中最终测试瓶中的pH值(包含微生物和产品)应为5.0±0.2或9.0±0.2。 5.2.2.8.7 十二烷基硫酸钠(化妆品工业) 制备50g/l的水溶液,并高压灭菌。 最终测试时的浓度为5g/l。 5.3 设备和玻璃仪器 5.3.1 综述 对所有的玻璃仪器和可能接触到样品、培养基和试剂的设备进行灭菌(本身即为无菌包装的除外),灭菌的方法可以有如下几种: A) 高压灭菌锅湿热灭菌(参见5.3.2.1a) B) 热鼓风烘箱干热灭菌(参见5.3.2.1b) 5.3.2 常规微生物实验室设备 5.3.2.1 灭菌设备 A) 湿热灭菌: 高压灭菌锅(能维持在121±3℃,15分钟以上) B) 干热灭菌: 热风烘,180℃至少保持30分钟,或170℃至少保持1小时,或160℃至少保持2小时 5.3.2.2 水浴:水温控制精度不低于±1℃,可以控温在(20±1)℃和(45±1)℃,后者用于保存熔化的培养基用于浇平板。 5.3.2.3 培养箱 能控制温度范围36±1℃或者37±1℃。 5.3.2.4 pH计: 25℃时测量精度0.1pH单位 注: 配备平板膜电极用于测量琼脂培养基的pH值。 5.3.2.5秒表 5.3.2.6 搅拌器 漩涡振荡器,机械搅拌器 5.3.2.7 膜过滤装置,由与待过滤物质相容的材质制成 该装置配有至少50ml的漏斗头,能够安装直径47mm至50mm的0.45um孔径的滤膜,用于过滤硬水、牛白带白溶液、蔗糖溶液。 真空抽滤装置需要能够均匀的抽气,以确保微生物在膜表面均匀分布并且防止过长时间抽滤。 该装置应能满足在20-40秒钟过滤100ml冲洗液。 5.3.2.8 冰箱,控温范围2-8℃ 5.3.2.9 移液管 :10ml,1ml,0.1ml或标定过的全自动移液管 5.3.2.10 培养皿:直径 90-100mm 5.3.2.11 玻璃珠:直径 3-4mm 5.3.2.12 容量瓶 5.4 测试用菌悬液和样品溶液的制备 5.4.1微生物悬液(测试和验证实验菌悬液) 5.4.1.1 综述 对每种微生物,需准备两种不同的菌悬液:测试用菌悬液和验证用菌悬液(用于方法验证和空白对照) 5.4.1.2 保存菌种 测试菌种根据EN12353的要求进行保存 5.4.1.3 工作菌种 a) 细菌: 将保存菌种接种至新鲜TSA斜面在36±1℃条件下培养18-24小时,然后从新鲜培养斜面挑取培养物转移至新的斜面上同样条件下培养18-24小时。如有需要可以在第2次培养斜面基础上进行第三次培养。 注:第二次或第三次培养物即为工作菌种。 如果因为时间关系无法连续制备第二次培养物,可以第一次培养时直接培养48小时,然后再次转接培养24小时作为工作菌种。不要进行第4次培养。 对于额外的菌种,任何偏离以上培养方法的方法都要记录在报告中并作出解释。 5.4.1.4 测试用菌悬液(N) a)取10g稀释液(参见5.2.2.4 )置于100ml烧瓶中,加入5g玻璃珠(参见5.3.2.11)。取工作菌种,用接种环转移数环培养物至稀释液中。转移时将接种环浸入稀释液中,并在烧瓶壁摩擦以使菌细胞更多的进入稀释液中。在机械摇床上振荡3分钟后,将菌悬液转移至另一试管中,使用稀释液调节菌浓度至1.5*10^8 cfu/ml至5*10^8 cfu/ml。菌浓度可以通过分光光度法或者其他合适方法确定。将菌悬液保持在20±1℃水浴中并在2小时之内使用。 注: 强烈建议使用分光光度计在620nm波长下测量10mm光程的比色管内微生物悬液的吸光度来调节细胞浓度。每个实验室对于自己使用的每种菌种都应该有在0.150~0.460吸光度区间里的校正数据。 b)计数时,使用稀释液将细菌悬液(5.4.1.4a)稀释到10^-6和10^-7稀释度,充分混匀稀释的菌悬液。 1) 若使用倾倒法计数,吸取细菌稀释液1ml至无菌平板内,浇入熔化的45℃左右的TSA培养基15-20ml,摇动培养皿使稀释菌液和培养基充分混匀后静止待凝固。每个稀释浓度做两块平行平板。 2)若使用涂板技术计数,则将每1ml菌液分成等比例的几部分加于表面干燥的TSA平板上涂布均匀。每个样品重复一次。 培养和计数参见5.4.1.6节 5.4.1.5 验证用菌悬液(Nv) 1)将测试用菌悬液(参见5.4.1.4)用稀释液(参见5.2.2.4)进行稀释,得到细菌数量在 3.0×10^2cfu/ml到1.6×10^3cfu/ml(大约是测试用菌悬液10^-5稀释度的四分之一浓度)。 2) 计数时,准备10^-1稀释度的稀释液,吸取1ml该悬液用倾倒法或涂板法制备培养平板。每个样品重复一次。 培养和计数参见5.4.1.6节 5.4.1.6 测试用菌悬液和验证用菌悬液的平板培养和计数 a)平板在36±1℃或37±1℃下培养20到24小时,丢掉无法计清数目的平板,对其余平板进行计数。继续培养20到24小时,对于出现无法计清数目的平板不再计数,对其他平板进行计数。如果计数值在增加,则仅使用较高值用于后续计算。 b)标明每块平板具体的菌落数,对于数量超过330的平板则标记为“>330”,并根据5.6.2.2计算Vc值。 c)根据5.6.2.3和5.6.2.5所列的方法计算出测试用菌悬液中菌浓度N(cfu/ml)和验证用菌悬液的浓度Nv(cfu/ml)。根据5.7进行验证。 5.4.2 测试样品溶液 配制测试样品溶液准,其浓度要是设定的测试浓度的1.25倍,这是因为在测试和方法验证时,其浓度被微生物悬液和干扰物质等稀释到80%水平。产品的测试溶液需用硬水进行配制(参见5.2.2.7),所选取的三个不同浓度必须包含一个有效浓度(有杀灭效果)和一个非有效浓度(无杀灭效果)。收到的产品本身有时可以直接作为其中一个测试浓度,此时最高的测试浓度仅为其本身的80%。 对于可直接使用的产品的稀释需使用蒸馏水(参见5.2.2.2)进行。 对于固体产品,称取1.0g±10mg样品,溶解在容量瓶中,并用硬水稀释。如有需要则在容量瓶中继续稀释至合适浓度。 对于液体产品,使用硬水在容量瓶中进行稀释。 产品测试溶液需要新鲜配制并在2小时内用完。这些溶液在整个测试过程中必须保持均一稳定。如果测试过程中出现沉淀或者絮凝等可见的不稳定现象,则在测试报告中如实记录该现象。 报告中所声名的产品浓度必须是实际测试时体系中产品的浓度。测试浓度以体积/体积或者重量/体积的形式给出。 5.5 评价产品杀细菌活力的程序 5.5.1综述 5.5.1.1 实验条件(必须条件和额外条件) 除了必须的温度、接触时间、干扰物质和测试菌种等条件外,额外的实验条件(包括菌种)可以根据产品的实际使用条件(参考第4条)进行选择: a) 测试温度(θ,℃): --- 必须的测试温度为20℃ --- 额外的可选择的测试温度包括4℃,10℃,30℃或者40℃ --- 每个选择的温度允许的偏差为±1℃ b) 接触时间(t,min) --- 必须的接触时间为5分钟或者1分钟(手消毒) --- 额外的可选择的接触时间包括1分钟,15分钟,30分钟和60分钟 --- 每个所选的接触时间的偏差为±10秒(1分钟除外,1分钟时允许偏差为±5秒) c) 干扰物质: --- 必须的测试干扰物质是0.3g/l的牛白蛋白(清洁环境)或者3.0g/l的牛白蛋白(污染环境) --- 对于其他的干扰物质的选择,根据产品应用领域的不同可以参考5.2.2.8 d) 菌种:参见5.2.1 必须使用的菌种包括铜绿假单胞菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和兼性肠球菌。如果特定的应用领域需要,可以使用的额外的菌包括:鼠伤寒沙门氏菌,短乳杆菌和阴沟肠杆菌。 5.5.1.2 测试方法的选择(稀释中和法或者膜过滤法) 对于稀释中和法,为了确定合适的中和剂,根据已公开数据和实验室经验选择合适的中和剂,并且根据5.5.2.3,5.5.2.4和5.5.2.5进行中和效果验证。 如果中和剂无效,根据附录B提供的信息更换新的中和剂后重复验证其效果。 5.5.1.3 验证和空白对照程序的综述 对于每个实验条件(干扰物质、测试温度和接触时间)以及每种测试微生物,在进行中和剂中和效力验证是只需要验证最高浓度的产品溶液即可。这些程序(实验条件的空白,中和剂空白或过滤空白,方法验证)和实际测试在同样的中和剂、冲洗剂条件下同时进行。 对于直接使用型的产品,使用水代替硬水进行稀释。 如果由于中和要求的需要,将中和剂加入TSA中用于验证和空白程序,所使用的TSA里应该添加同样量的中和剂。 5.5.1.4 温度平衡 测试之前,所有的试剂(产品测试溶液,测试用菌悬液,验证用菌悬液,稀释液,硬水和干扰物质等)需要放入θ℃水浴中恒温。检查所有试剂的温度均稳定在θ℃。 中和剂或冲洗剂以及水需要恒温至(20±1)℃ 对于直接使用型的产品,水同样需要恒温到θ℃。 5.5.1.5 操作微生物时的注意事项 在加入测试菌悬液或者验证菌悬液时,不要接触到试管的顶端部位。 5.5.2 稀释-中和法 5.5.2.1 综述 所有的测试、空白和验证(5.5.2.2到5.5.2.5),对于每个特定的实验条件,均需要做平行实验。 5.5.2.2 杀菌浓度的测定(Na) 测定杀菌浓度的具体过程如下: a) 吸取1ml干扰物质(5.2.2.8)至试管中,加入1.0ml测试菌悬液(5.4.1.4)。迅速启动秒表,混匀管内液体后将其快速放入设定好温度θ的水浴池内,保持2分钟±10秒。 2分钟时间过后,加入8.0ml某一测试样品溶液(5.4.2)。刚开始加入时即重启秒表计时。混匀管内液体后快速放入设定好温度θ的水浴池内,等待接触时间t(5.5.1.1b)分钟,在即将结束接触时间之前,再次快速混匀管内液体。 b) 接触时间过后,取出1.0ml混合液(Na),转移至含有8ml中和剂( 5.2.2.5)溶液的试管中,同时加入1.0ml水。混匀后将试管放在(20±1)℃水浴中。中和时间5分钟±10秒,结束后混合管内液体并迅速取出1.0ml中和后的混合测试液(Na)(含有中和剂,样品溶液,干扰物质和测试用菌悬液)分别使用倾倒法或涂板法接种计数。每个样品重复一个平行样。 1) 若使用倾倒法计数,吸取细菌稀释液1ml至无菌平板内,浇入熔化的45℃左右的TSA培养基15-20ml,摇动培养皿使稀释菌液和培养基充分混匀后静止待凝固。 2) 若使用涂板技术计数,则将每1ml菌液分成等比例的几部分加于表面干燥的TSA平板上涂布均匀。 培养和计数参见5.5.2.6节 c)同时按照同样的测试方法,测试其他的产品溶液。 d)按照a-c的步骤测试其他的必须的和可选的实验条件(如菌种,温度等) 5.5.2.3 空白实验—验证所选的实验条件,确认这些测试条件不存在对结果的破坏性 a) 吸取1ml干扰物质(5.2.2.8)至试管中,加入1.0m验证用菌悬液(5.4.1.5)。迅速启动秒表,混匀管内液体后将其快速放入设定好温度θ的水浴池内,保持2分钟±10秒。 2分钟时间过后,加入8.0ml硬水(对于直接使用的产品,使用纯水代替硬水)。刚开始加入时即重启秒表计时。混匀管内液体后快速放入设定好温度θ的水浴池内,等待接触时间t(5.5.1.1b)分钟,在即将结束接触时间之前,再次快速混匀管内液体。 b) 接触时间过后,取出1.0ml混合液(A)分别使用倾倒法或涂板法接种计数。每个样品重复一个平行样。 培养和计数参见5.5.2.6节 5.5.2.4 中和剂空白测试—验证中和剂无毒性 a) 吸取8ml中和剂至试管中,加入1ml水。加入1.0m验证用菌悬液(5.4.1.5)。刚加入时迅速启动秒表,混匀后将试管放在(20±1)℃水浴中。中和时间5分钟±10秒,结束前再次混合管内液体。 b) 接触时间过后,取出1.0ml混合液(B)分别使用倾倒法或涂板法接种计数。每个样品重复一个平行样。 培养和计数参见5.5.2.6节 5.5.2.5 稀释-中和方法验证 a) 吸取1ml干扰物质(5.2.2.8)至试管中,加入1.0ml稀释液(5.2.2.4)。启动秒表,加入8.0ml测试样品最高浓度的溶液,混匀管内液体后快速放入设定好温度θ的水浴池内,等待接触时间t(5.5.1.1b)分钟,在即将结束接触时间之前,再次快速混匀管内液体。 b) 接触时间过后,取出1.0ml混合液,转移至含有8ml中和剂(5.5.2.2使用)溶液的试管中,混匀后将试管放在(20±1)℃水浴中。中和时间5分钟±10秒。结束后加入1.0ml验证用菌悬液(5.4.1.5)。刚加入时即启动秒表,将该试管放入(20±1)℃水浴中30±1分,结束前再次混合管内液体。结束后迅速取出1.0m混合测试液(C)分别使用倾倒法或涂板法接种计数。每个样品重复一个平行样。 培养和计数参见5.5.2.6节 5.5.2.6 测试、空白和验证混合液的培养与计数 a)平板培养20到24小时,丢掉无法计清数目的平板,对其余平板进行计数。继续培养20到24小时,对于出现无法计清数目的平板不再计数,对其他平板进行计数。如果计数值在增加,则仅使用较高值用于后续计算。 b)标明每块平板具体的菌落数,对于数量超过330的平板则标记为“>330”,并根据5.6.2.2计算Vc值。 c)根据5.6.2.4和5.6.2.6所列的方法计算出测试混合液(Na)中菌浓度(cfu/ml)和验证混合液A,B,C中菌的浓度(cfu/ml)。根据5.7进行验证。 5.5.3 膜过滤方法 5.5.3.1 综述 所有的测试、空白和验证(5.5.3.2到5.5.3.5),对于每个特定的实验条件,均需要做平行实验。 每套膜过滤装置都必须安装0.45μm孔径的的滤膜(直径47mm到50mm),冲洗液的用量为50ml。过滤时间如果个别情况下超过1分钟,需要在报告里面注明。当转移滤膜至琼脂培养基表面时,需要小心轻放,确保测试的微生物都在膜上面并且膜与琼脂之间没有空气。 5.5.3.2 杀菌浓度的测定(Na) a)参见5.5.2.2.a b)接触时间t结束后,取0.1ml测试混合液(Na)转移至单独的膜过滤装置中,快速过滤,使用至少150ml(但不多于500ml)冲洗液。如果冲洗液不是水,则最后使用50ml水完成整个冲洗过程。将膜转移至TSA平板表面。每个测试样品重复一次。 培养和计数,参见5.5.3.6 c)参见5.5.2.2c d)参见5.5.2.2d 5.5.3.3空白实验—验证所选的实验条件,确认这些测试条件不存在对结果的破坏性 a)参见5.5.2.3a b)接触时间t结束后,取1.0ml测试混合液(A)转移至单独的膜过滤装置中,快速过滤,使用至少150ml(但不多于500ml)冲洗液。最后使用50ml水完成整个冲洗过程。将膜转移至TSA平板表面。每个测试样品重复一次。 5.5.3.4 过滤空白验证 取0.1ml验证用菌悬液(5.4.1.5,空白对照B),转移至单独的膜过滤装置中,快速过滤。按照 5.5.3.2b中同样的方式过滤冲洗液。如果冲洗液不是水,则最后使用50ml水完成整个冲洗过程。将膜转移至TSA平板表面。每个测试样品重复一次。 培养和计数,参见5.5.3.6 5.5.3.5 方法验证C—验证膜过滤方法,经过样品溶液和干扰物溶液过滤过的膜表面微生物生长的验证 a)参见5.5.2.5a b)接触时间t结束后,取0.1ml验证混合液C,转移至单独的膜过滤装置中,快速过滤。按照 5.5.3.2b中同样的方式过滤冲洗液。然后加入50ml冲洗液(5.2.2.6)并且加入0.1ml验证用菌悬液(5.4.1.5)。再次快速过滤,并且最后使用50ml水完成整个冲洗过程。将膜转移至TSA平板表面。每个测试样品重复一次。 培养和计数,参见5.5.3.6 5.5.3.6测试、空白和验证混合液的培养与计数 a)将平板培养20-24小时。丢弃所有无法计数的平板。统计膜表面的菌落数。将被统计平板再次培养20-24小时。对于菌落不再单独可数的平板不再计数。其余平板再次计数,如果有菌落数增加,则仅仅使用菌落更多的数据作后续计算。 b)记录每块平板的准确菌落数,对于菌落数多于165的平板记作“>165”,并根据5.6.2.2计算Vc值。 c)根据5.6.2.4和5.6.2.6所列的方法计算出测试混合液(Na)中菌浓度(cfu/ml)和验证混合液A,B,C中菌的浓度(cfu/ml)。根据5.7进行验证。 5.6 数据与计算 5.6.1 术语和符号定义 5.6.1.1 不同悬液和测试混合液 N:测试用菌悬液(5.4.1.4) Nv:验证用菌悬液(5.4.1.5) Na:菌悬液在特定条件下与杀菌剂作用后,经中和之后的混合液,即杀菌测试混合液 A: 空白实验(验证干扰物质,实验环境等对微生物不具破坏性)混合液 B: 中和剂空白实验混合液(验证中和剂对微生物无毒性) C: 方法验证(中和剂效力验证)实验混合液 表一列出了各种符号代表的每毫升不同混合液的计数微生物数量: 表1 不同混合液微生物计数(cfu/ml) 菌悬液计数 最开始混合悬液计数(接触时间=0) 接触时间(A为t分钟,B为5分钟,C为30分钟)过后混合悬液计数 测试 N 测试用菌悬液 N0(=N/10) Na(中和之前或者过滤之前) 空白对照 Nv 验证用菌悬液 Nv0(=Nv/10) A,B,C 5.6.1.2 Vc值 所有的数据均以Vc值的形式给出: --- 在稀释-中和法中(样品测试和空白),Vc值即为每1.0毫升样品的菌落形成单位数(cfu) --- 在膜过滤方法中,Vc值对于测试样品悬液Na,为每0.1毫升样品的菌落形成单位数(cfu);Vc值对于空白样品A为每1.0毫升样品的菌落形成单位数(cfu);Vc值对于空白样品B和C为每0.1毫升样品的菌落形成单位数(cfu) 5.6.2 计算 5.6.2.1 综述 数据计算第一步: 确定Vc值 第二步: 计算N,N0,Na,Nv,Nv0,A,B,C 第三步: 计算减少值R(参见5.8) 5.6.2.2 Vc值计算 a)通常平板细菌计数的范围为15-300。本标准中,10%的误差范围是可以接受的,因此计数范围为14-330。膜过滤方法中膜上菌计数的数量上限为150,因此在10%误差之后,上限为165。 b) 对于测试菌悬液(N,5.4.1.6),验证菌悬液(Nv,5.4.1.6)和稀释中和法中所有的平板计数,Vc值均按照每1毫升混合液样品所含微生物数量记录和计算。 如果一块平板上数量超过330,则报告“>330”.如果1ml样品在几块平板中一起培养计数,其中至少一块平板上数量超过330,则以所有平板上的数量之和作为报告数值(比如,对于计数为330,310,302的三块平板,则报告为“>942”)。 如果Vc数值低于14,则如实报告该数字,但是在后续计算中使用“<14”(对于Na计数时的情况)。 对于膜过滤方法,Vc值即为每张膜上的计数值。按照如前所示的方法报告超出范围的值(<14或者>165) c)仅仅使用在计数范围里面的Vc值,除了Na计数时的情况例外。 5.6.2.3 计算N和N0 N是测试用菌悬液中的微生物数量(cfu/ml)(参见5.4.1.4和5.4.1.6) 由于测试用菌悬液计数时使用了两个稀释梯度,按照如下公式计算菌浓度(cfu/ml): 其中, c代表了所有四块平板的Vc值之和 n1 代表了低稀释度(例如10-6)条件下,用于计算的Vc值数量 n2 代表了高稀释度(例如10-7)条件下,用于计算的Vc值数量 10-6代表稀释系数 计算结果按照四舍六入五成双的方法,表述成科学计数形式,包留一位小数。 例如: N0代表接触时间开始之前,每1毫升混合测试液中的微生物数量,根据稀释量计算,等于最开始测试用菌浓度的1/10。 5.6.2.4 计算Na Na代表了测试混合液接触时间完成后,中和或者过滤之前,每毫升测试液中存活的微生物数目。根据稀释液和水混合导致菌液浓度被稀释,所以Na等于计数得到的Vc值得10倍。 按照如下公式计算Na: Na=10c/n 其中,c为计算使用的所有Vc数据之和 n为列入计算的Vc值的个数 如果某一样品的两个重复样本中的一个或者两个Vc值超过计数范围,则结果表示为“≥”或“≤” 举例如下: a) 重复的Vc值为:2,16 b)重复的Vc(膜过滤方法)值为: >165, >165 c)重复的Vc值(每1毫升混合液涂两块平板)为:>660,600 5.6.2.5 计算Nv和Nv0 Nv为验证用菌悬液里微生物浓度(cfu/ml),由于计数过程中经过了10倍的稀释,因此其值等于Vc值的10倍。 Nv0是A,B,C混合液在未进行接触阶段时(t=0),每1毫升混合液中的微生物数量,由于混合过程中经过了稀释,其值为Nv的1/10。 Nv=10c/n Nv0=c/n 其中,c为计算使用的所有Vc数据之和 n为列入计算的Vc值的个数 5.6.2.6 计算A,B,C A,B,C分别代表了各自混合液每1毫升所含的活菌数量: A 代表空白试验接触时间t完成之后的混合液每1毫升所含微生物数量 B 代表中和剂空白验证或者膜过滤空白验证接触时间5分钟后混合液每1毫升所含微生物数量 C 代表方法有效性验证试验接触时间30分钟后混合液每1毫升所含微生物数量 这些数值等于对应的Vc值得平均值。 A,B,C=c/n 其中,c为计算使用的所有Vc数据之和 n为列入计算的Vc值的个数 5.7 方法学验证 5.7.1 综述 根据本标准,一次测试需满足以下条件才能有效: --- 所有的结果符合5.7.3的规定 --- 满足5.8.2所规定的所有要求 5.7.2 加权平均计数的要求 对于两个不同稀释度的加权平均值的计算,两个稀释度各自平均值的比值应在5-15之间,不能在此范围之外。在进行改标准评价时,单个平板计数结果若低于14的则按照14来计算,如果高于上限范围则以上限数值来评判。 例如: 对于10-6稀释度: 168cfu/ml,215cfu/ml, 10-7稀释度:20cfu/ml,<14cfu/ml,计算如下: (168+215)/(20+14)=11.26,介于5到15之间,因此该组数据有效。 5.7.3 基本规定 对每种测试微生物,结果规定如下: a) N值介于1.5*10^7至5.0*10^7之间(7.17≤lgN≤7.70)(不确定这个地方是否对) N0值介于1.5*10^6至5.0*10^6之间(6.17≤lgN0≤6.70) b) Nv0介于30至160之间(3.0*10至1.6*10^2) Nv介于3.0*10^2至1.6*10^3 c)A,B,C均不小于0.5Nv0 d)加权平均计数值满足5.7.2 5.8 结果表述和精度 5.8.1 微生物数量减少 微生物数量的减少通过对数值变化的形式来表达。 对每种微生物,根据计数结果得知测试用菌悬液中菌浓度N(cfu/ml)和测试后混合液菌浓度Na(cfu/ml),计算出测试前混合液菌浓度N0(cfu/ml, 1/10N) 对于每种产品浓度和特定的试验条件,计算并记录对数值减少: lgR=lgN0-lgNa 5.8.2 有效和无效产品浓度 每个测试产品的浓度系列,至少有一个可以获得5个(或)以上对数值减少,至少有一个获得少于5个对数值的减少。 5.8.3 对于每种测试微生物,记录通过测试的最低产品浓度 将测试中需要最高的产品浓度才能通过测试的微生物定义为限度微生物(对于选定的测试条件和产品最不敏感的微生物) 对于限度微生物有效的最低产品浓度定义为该产品的细菌杀灭浓度(根据本标准) 5.8.4 精度,可重复性 5.9 结果说明--- 结论
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分类:医药卫生
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