革兰氏染色及镜检操作规范培训质量管理部目录一、革兰氏染色法二、革兰氏染色原理三、仪器设备、试剂四、操作
方法
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五、镜检及结果判定六、革兰氏染色图片七、革兰氏染色注意事项八、革兰氏染色小结一、革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，革兰氏阳性菌（G+）不被脱去，革兰氏阴性菌（G-）可被脱去。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现阴性反应。G+和G-生物学特性的差异比较项目G+细菌G-细菌革兰氏染色反应能阻留结晶紫而染成紫色可经脱色而复染成红色肽聚糖厚，层次多薄，一般单层磷壁酸多数含有无外膜无有脂多糖（LPS）无有类脂和脂蛋白含量低（仅抗酸性细菌含有类脂）高鞭毛结构基体上着生2个环基体上着生4个环产毒素以外毒素为主以内毒素为主对机械力的抗性强弱阴性菌阳性菌二、革兰氏染色原理G+菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多且交联程度大，故经酒精脱色，失水而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故酒精处理，能把结晶紫和碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。G-菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄且交联程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色，再经沙黄等红色染料复染，就使G-菌呈红色。三、仪器设备、试剂生物显微镜载玻片草酸铵结晶紫染色液革兰氏碘液沙黄复染液或番红染色液95%乙醇5、革兰氏染色液配制5.1草酸铵结晶紫染液A液：结晶紫2g ，95%乙醇20mL。B液：草酸铵0.8g， 蒸馏水80mL 混合A液及B液，静置48h后使用。5.2碘液配制碘片1g， 碘化钾2g ，蒸馏水300mL 配制方法：先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加够蒸馏水即可。5.3番红复染液配制番红2.5g， 95%乙醇100mL 取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL蒸馏水混匀既成。四、操作方法1、制片在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层。为避免因菌数过多聚成团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。若材料为液体培养物或固体培养物冲洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可2、自然干燥涂片最好在室温下使其自然干燥。有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。3、固定标本干燥后即进行固定，固定的目的：１）杀死微生物，固定细胞结构。２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上。在酒精灯外焰尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。4、初染滴草酸铵结晶紫染1分钟蒸馏水冲洗。5、媒染加革兰氏碘液染1分钟蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分。6、脱色加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后立即用蒸馏水冲洗。用吸水纸吸去水分。7、复染蕃红染色液（稀）（或沙黄）复染液染1分钟后，用蒸馏水冲洗，并自然干燥。镜检。五、镜检及结果判定接通显微镜的电源，调节光线的强度。将载玻片放在载物台上，调节镜头至油镜镜头处，调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋至清晰为止。观察菌落形态及菌体的颜色。革兰氏阳性菌染色呈紫色，革兰氏阴性菌染色呈红色。六、革兰氏染色图片革兰氏染色的大肠杆菌革兰氏染色的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌革兰染色的伤寒沙门菌革兰染色的福氏志贺菌七、革兰氏染色注意事项标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不在出现紫色为止。染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水。选用培养物时，G+菌培养12h-16h，G-培养24h。菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定，需要多加练习。八、革兰氏染色小结革兰氏染色法.swf此
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