质粒DNA 酶切鉴定

实验五质粒DNA的微量提取及酶切鉴定字体：丄质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的环形双链DNA分子。一、质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解；质粒DNA的分离和纯化。1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或TB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于拷贝数较低的质粒（如PBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉素可以抑制宿主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。（问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ：提取质粒时，对于不同拷贝的质粒，应如何进行细菌的培养？为什么？）2、细菌的收集、裂解和质粒DNA的分离细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。利用溶菌酶和加热处理的方法，使细菌的线状染色体DNA变性，通过离心，可以使染色体DNA和变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒分子仍留于上清中。问题1：某些大肠杆菌的菌株不能用加热的方法裂解。（1）易产生多糖的如大肠杆菌菌株，如HB101和TG1等。尤其是HB101的一些变种和衍生物，在用去污剂或加热裂解时可释放处相对大量的糖，从而影响质粒的纯化，抑制多种限制性内切酶的活性。（2） 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+），如HB101。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2存在下温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。但通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可易避免此问题。3、质粒DNA的纯化纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基本性质。多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心一直是制备大量质粒DNA的方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀（聚乙二醇和LiCI分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白和RNA，达到纯化的目的。二、质粒在细胞内的复制，一般分两种类型：严密控制型(stringentcontrol):只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。松弛控制型(relaxedcontrol):质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。三、质粒DNA分子具有三种构型:共价闭合环状DNA(cccDNA,SC构型)、开环DNA(0C构型)和线形分子(L构型)。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA,尽管分子量相同，但是有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNA。300025001000750OCDNALDNASCDNA四、质粒DNA微量提取程序。五、限制性内切酶酶切注意事项在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题:加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。大多数限制酶贮存在50%甘油溶液中，以避免在-20T条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。多种因素可引发星型反应:①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug:④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。3.反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。4.当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA,然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。反应混合液中加入浓度为0・1mg/ml的BSA,可维持酶的稳定性。酶切底物DNA应具备一定的纯度,其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚,大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。7•要保证酶作用时的最佳反应条件（ph,温度）和底物用量，酶反应才能有效地进行。反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。五、常用的凝胶电泳技术有：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。六、电泳的原理：凝胶电泳的原理比较简单。我们知道当一种分子放置在电场中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说,电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反映活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子量大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。七、电泳中常用的电泳缓冲液Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（TAE）：Tris-硼酸盐缓冲液（TBE）：Tris-磷酸盐缓冲液（TPE）：这些缓冲液工作都很好，选择哪一种主要看个人的工作习惯。区别：（1）TAE缓冲容量最低，长时间电泳会被消耗，凝胶的阳极一侧将发生酸性化定期更换缓冲液货调换两个电极的缓冲液可以防止TAE的消耗。（2）TBE和TPE比TAE稍贵些，但它们有高得多得缓冲容量。（3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10％‘（4）对于高分子质量DNA，TAE的分辨率略高于TBE和TAE。八、在琼脂糖凝胶电泳中，加入溴化乙锭的作用：溴化乙锭（ethidiumbromide,简称EtBr）会插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，将电泳放置在紫外光下观察，便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带位置。九、电泳中，凝胶加样缓冲液（LoadingBuffer）的作用：（1）增加样品密度，以保证DNA沉入加样孔中；（2）使样品带有颜色，便于简化上样过程；（3）其中的染料，在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝的迁移速率约与长300bp的线状双链DNA相同二甲苯氰FF约与长4000bp的DNA相同。