8株光合细菌的鉴定及其系统进化关系分析

�收稿日期 �2010�02�09 �作者简介 �方立超 ( 1973�) ,女,讲师,博士,从事医学微生物学研究, Em ai:l k lk300@ 163. com; 魏泓, 通讯 作 者, Em ai:l w eih ong63528@ 163. com; 郑峻松, 并列通讯作者, Em ai:l zhengalpha@ yahoo. com 文章编号: 1005�376X( 2010) 05�0439�05 �论 著 � 8株光合细菌的鉴定及其系统进化关系分析 方立超 1,魏泓 2,郑峻松 1 (第三军医大学 1.医学检验系暨药学院临床检验学教研室; 2.基础部实验动物学教研室, 重庆 400038) �摘要� 目的 为 8株光合细菌 ( pho tosynthe tic bac teria, PSB)作为益生菌株提供系统资料。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 用常规方 法对 8株 PSB菌株的形态、培养特性及生理生化特征进行鉴定, 同时定性分析菌株产生的类胡萝卜素和 CoQ,测定 菌株 16S DNA序列并分析其系统进化关系, 在 GenBank中获取了 8个 16S DNA序列号。结果 菌株鉴定结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:菌株 2C、2c和 13ing为沼泽红假单胞菌, G a、Il106、WS8N为类球红细菌, MT1131为荚膜红细菌, rub为深红红螺 菌。基于菌株 16S DNA序列的系统进化树显示, 同一种菌并不总是聚为一簇, 但相隔较近; 种属完全不同的菌株, 尽管序列相似性高达 97%以上,在系统进化树上相隔较远。结论 8株 PSB菌株的鉴定和系统进化关系分析结果 为后续研究提供了背景资料,同时菌株在 GenBank中获得的 16S DNA序列号为菌株作上了生物标记, 也为菌株的 产权保护提供了依据。 �关键词� 光合细菌; 16S DNA序列; 系统进化关系;益生菌; 背景资料 �中图分类号 �Q 939. 9 �文献标识码 �A Identification of 8 photosynthetic bacteria strains and analysis of their phylogenetic relation FANG L i�chao1, WE IHong2, ZHENG Jun�song1 ( 1. D epartm ent of Clinical LaboratoryM ed icine, C ollege of Pharm acy and LaboratoryM ed icine, Th ird M ilitaryM edical Uni� versity, Chongq ing 400038, China; 2. D epartm ent of Laboratory Animal Science, College of B asic M edicine, Third M ilitary M edical University, Chongq ing 400038, Ch ina) �Abstract� Objective To prov ide system atic data for pho tosynthetic bacter ia as potential prob io tics. M ethod The m orpho log ic and cu ltura l properties a long w ith the phy sio log ic and b iochem ica l character istics o f 8 Photosynthetic bac teria ( PSB) w ere analyzed. The caroteno ids and Coenzym e Q produced by the stra ins w ere also analyzed qua litative ly. The 16S DNA sequences and their phy logenetic re la tion were ana lyzed too; A ccession numbers of the stra ins!16S DNA sequences in G enBank were a lso acquired. Resu lt The identification o f the stra ins show ed that strain 2C, 2c and 13 ing we re Rhodop� seudom onas palusris, wh ile Stra in Ga, I l106 andW S8N w ereR hodobacter sphaeroid es; StrainMT1131 w as Rhodobacter cap� su la tus; Stra in rub was R hodo sp irilum rubrum. The phy log enetic re la tion ana lys is based on their 16S DNA sequences show ed the sam e spec ies did not always gather into a c luster, but w ere rather c loser. A lthough the s im ilar ity o f the ir se� quences we re as h igh as above 97% the strains belonged to different genus and species. Conclusion The results o f identi� fica tion and phy logene tic re la tion ana lysis o f the strains prov ide background da ta for further research. A t the sam e tim e the accession num bers o f the 16S DNA sequences o f the stra ins acquired in GenBank afforded bio�m ark and basis fo r inte llectu� al property pro tection for the strains . �Keyw ords� Photosynthetic bacter ia; 16S DNA sequences; Phy logene tic re la tion; P rob io tics; Backg round data 光合细菌 ( Photosynthe tic bacteria, PSB )是 20亿 年前地球上最早出现的原核生物,它与其他生物一起 构成了自然界生态系统中的原始生产者,并在自然界 碳素循环和物质转化中起着重要作用。由于 PSB含 有丰富的营养药用成分及其独特的生物转化功能,在 医药保健品方面的应用研究有了新的发展。当前在 国外, PSB已在保健食品中应用 [ 1] , 但在国内 PSB尚 未列入可用于保健食品的菌种名单内,仅沼泽红假单 439中国微生态学杂志 2010年 5月第 22卷第 5期 胞菌已获准用于饲料添加剂。可见 PSB在保健食品 和药品中的应用已具有一定基础, 但尚缺乏 PSB作 为益生菌株益生特性的系统资料。本文对 8株 PSB 菌株的形态、培养特征、产生的类胡萝卜素和辅酶 Q、 生理生化特征、16SDNA序列及其系统进化关系进行 分析, 并在 G enB ank中获取菌株 16S DNA序列号, 为 菌株的后续研究提供了背景资料,同时为菌株作上了 生物标记。 1 材料与方法 1. 1 PSB 菌株 PSB 菌 株 G a、 Il106、WS8N、 MT1131、rub、13 ing、2C和 2c (以上菌株为第三军医 大学实验动物学教研室实验室保藏 )。 1. 2 主要试剂及培养基 M arker是 DNA M arker DL2000, C ode D501A, Lo t CD3401( TaK aRa公司 ) , 细 菌基因组 DNA抽提试剂盒 ( V IOGENE ) , PCR扩增试 剂盒 ( TaKaR a公司 TaKaR aEx TaqTM DRR01CM ), PCR 产物纯化试剂盒 (上海华舜生物工程有限公司的小 量胶回收试剂盒 ) , 细菌通用引物 (上海基康生物技 术有限公司合成 ), 琼脂糖 ( TBD) , RCVBN液体培养 基,普通营养琼脂培养基, C oQ10和 ��胡萝卜素 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品 ( S igm a) ,其他常规生化试剂均为国产分析纯。 1. 3 主要仪器 恒温光照培养箱 HGP300 (中国科 学院武汉科学仪器厂 ) , UV 751GD紫外 /可见分光光 度计 (上海分析仪器总厂 ) , PTC�150型 PCR仪 (美 国 M JRESEARCH公司 ), 水平电泳仪 (江苏海门市 麒麟医用仪器厂 ), B io�Rad Ge lDoc2000型凝胶成相 系统 (美国 ) , WH�3型微型旋涡混合仪 (上海沪西分 析仪器厂 ) , - 80 ∀ 超低温冰箱 ( Thermo Fo rma, 美 国 ) , A geinet8453型紫外 /可见分光光度计 (美国 ) , JY92�II型超声波细胞粉碎机 (宁波新芝生物科技股 份有限公司 ) , RE �85C旋转蒸发器 (上海青浦沪西仪 器厂 )。 1. 4 方法 1. 4. 1 菌株形态特征、培养特征及生理生化特征鉴 定 用常规方法。 1. 4. 2 菌株产生类胡萝卜素的分析 菌体制备及类 胡萝卜素提取参照钱新民等的方法进行 [ 2]。用显色 反应、Carr�price反应、光谱分析方法对类胡萝卜素进 行定性分析 [ 2~ 4]。 1. 4. 3 菌株产生辅酶 Q的提取和定性分析 用皂 化法对菌株产生的辅酶 Q进行提取 [ 5] , 用 C raven试 验、紫外 /可见分光光度计扫描:在波长 190~ 320 nm 下对待测样品进行紫外扫描,测定其最大紫外吸收波 长。高效液相色谱法: 色谱柱为 ODS HypersilC18( 25 cm # 4. 0 mm ID ), 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂,以甲醇 /无水乙醇 (体积比为 1: 1)为流动相, 柱温 35 ∀ , 检测波长 275 nm,进样量 20 �l。 1. 4. 4 菌株 16S DNA序列测定 [ 6] 菌株 DNA的提 取按 V IOGENE公司的细菌基因组 DNA抽提试剂盒 操作说明进行;以上海基康生物技术有限公司合成的 16S DNA通用引物 ( F primer: 5!�AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG�3!, R primer: 5!�GGT TAC CTT GTT ACG ACT T�3!)进行 PCR扩增, PCR反应体系为 25 � ,l包括 10 # Buffer 2. 5 � ,l 25 mmo l/L M gC l2 1 � ,l 2. 5 mmo l/L dNTP 1 � ,l F和 R引物 ( 20 �mol/L )各 0. 5 � ,l 1 �l模板 DNA, 5. 0 U Taq DNA聚合酶 0. 25 � ,l去离子水 18. 25 �l。 PCR程序为: 94 ∀ 2 m in; 94 ∀ 30 s, 56 ∀ 1m in, 72 ∀ 45 s, 12个循环,并且每 个循环降低 0. 5 ∀ ; 94 ∀ 30 s, 50 ∀ 40 s, 72 ∀ 45 s, 35个循环; 72 ∀ 7 m in。扩增产物的纯化按上 海华舜生物工程有限公司的小量胶回收 PCR产物纯 化试剂盒说明,测序由上海基康生物技术公司完成, 测序引物为: 5!CAG AGT TCC CGA AGG CAC C 3!, 测序方法为 BDT法。 1. 4. 5 菌株系统发育树的构建 [ 7] 首先用 BLAST 方式将测定的序列与 nr( GenBank+ EMBL + DDB J+ PDB sequences)中细菌的 16S DNA序列进行比对,从 中选出相似性在 97%以上的几个序列, 再挑选沼泽 红假单胞菌 ( Rhodop seudomonas palustris )、类球红细 菌 (Rhodobacter sphaeroides)、深红红螺菌 (Rhodosp iril� lum rubrum )和荚膜红细菌 ( Rhodobacter cap sulatu s) 4个种的部分序列,将所有选出序列和已测定菌株的 共 28个序列存为 fasta格式的纯文本格式, 使用 CLUSTALX进行序列联配并构建系统发育树, 用 n j� p lo t软件中的 Bootstrap来分析评估树的稳定性。 2 结果 2. 1 PSB菌株形态及培养特征和生理生化试验 结 果见表 1、2。 440 Chinese Journal ofM icroeco logy, M ay�2010, Vo l�22N o�5 2. 2 菌株类胡萝卜素和辅酶 Q鉴定 2. 2. 1 菌株产生类胡萝卜素种类 根据色素在不同 有机溶剂中的特征吸收波长 (表 3) , 菌株可能含有 3, 4�脱氢紫菌红素和 /或脱水紫菌红素和 /或紫菌红 醇,单甲基螺菌黄素, 番茄红素和紫菌红素。 2. 2. 2 菌株 CoQ鉴定 Craven试验: 呈蓝色反应。 紫外分析结果: 样品在 ( 223 ∃ 1) nm和 ( 274 ∃ 1) nm 处有紫外吸收,前峰高较后者大,其峰形与 CoQ10标 准品基本一致。色谱分析结果: 样品保留时间与 CoQ10标准品一致。 13 ing、rub、WS8N、Ga、Il106、 MT1131、2c、2C和标准品的保留时间 ( m in)分别为 10. 297、10. 307、10. 282、10. 270、10. 281、10. 265、 10. 302、10. 276和 10. 276 ∃ 0. 003。 表 1 8株光合细菌形态及培养特征 项目 Ga Il106 WS8N 2c 2C 13 ing rub MT1131 碱性复红单染色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 Gram染色 - - - - - - - - 菌体大小 ( 1. 1 ~ 1. 5) �m # ( 1. 6 ~ 2. 1) �m ( 1. 1~ 1. 5) �m # ( 1. 6~ 2. 1) �m ( 1. 1~ 1. 5) �m # ( 1. 6~ 2. 1) �m ( 0. 5~ 0. 8 ) �m # ( 1. 1~ 2. 2 ) �m ( 0. 5~ 0. 8) �m # ( 1. 1 ~ 2. 2) �m ( 0. 5~ 0. 8) �m # ( 1. 1~ 2. 2 ) �um ( 0. 8~ 1. 0) �m # ( 7. 0 ~ 10. 0) �m ( 0. 6~ 1. 2 ) �m # ( 2. 0~ 2. 2 ) �m 菌体形态 球形或短杆状 球形或 短杆状 球形或 短杆状 杆状或长 卵形, 两端 圆钝 杆状或长 卵形,两端 圆钝 杆状或长 卵形,两端 圆钝 弧 % 螺状 短杆、卵形 菌 落 形 态 及 颜 色 YP平皿 光 滑、圆 润、突起, 无 色 或 红色 光 滑、圆 润、突 起, 无 色 或 红色 光 滑、圆 润、突起, 无 色 或 红色 光 滑、圆 润、突起, 无 色 或 红色 光 滑、圆 润、突起, 无 色 或 红色 光 滑、圆 润、突起, , 无 色 或 红色 光 滑、圆 润、突起, 无 色 或 红色 光 滑、圆 润、突起, 无 色 或 红色 YP斜面 无 色 或红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 淡粉红色 或无 红色 RCVBN平皿 细 小、光 滑、圆润、 突起 光 滑、圆 润、突起 光 滑、圆 润、突起 光 滑、圆 润、突起 光 滑、圆 润、突起 光 滑、圆 润、突起 光 滑、圆 润、突起 光 滑、圆 润、突起 RCVBN斜面 无 色 或红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 无 色 或 红色 液体厌氧培养 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 液体厌氧培养物 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 适宜生长的温度 30 ∀ ~ 40 ∀ 30∀ ~ 40 ∀ 30 ∀ ~ 40 ∀ 30 ∀ ~ 40 ∀ 30 ∀ ~ 40 ∀ 30 ∀ ~ 40 ∀ 30 ∀ ~ 40 ∀ 30 ∀ ~ 40 ∀ 适宜生长的 pH 7. 0~ 8. 0 7. 0~ 8. 0 7. 0 ~ 8. 0 7. 0~ 8. 0 7. 0~ 8. 0 7. 0~ 8. 0 7. 0 ~ 8. 0 7. 0~ 8. 0 注: ( 1 )表中 & - ∋表示阴性。 & + + + ∋表示菌株生长状态较好; ( 2 )在固体培养基上光照条件下菌落红色,黑暗条件下无色。 2. 3 菌株 16S rDNA序列分析 2. 3. 1 8株 PSB菌株的 16S DNA序列在 G enB ank 中所获得的序列号 Ga、 rub、2c、2C、WS8N、Il106、 MT1131 和 13 ing 分别 为 DQ001152、DQ001159、 AY834756、 DQ001155、 DQ001157、 DQ001153、 DQ001154和 DQ001158。 2. 3. 2 菌株 16S rDNA序列分析 8株 PSB菌株 16S DNA序列在 nr( G enB ank+ EMBL+ DDBJ+ PDB sequences)中 B las,t 8株菌各与其同种菌株 16S DNA 序列相似性结果如下: 菌株 Il106与序列号为 AL162757的类球红细菌菌株序列相似性为 86%, 菌 株 Ga与序列号为 DQ001156 (菌株 B )和 DQ001157 (菌株WS8N )序列相似性达 98%。菌株 MT1131与 序列号为 BX640420的荚膜红细菌菌株序列相似性 为 94%。菌株 rub与序列号为 BX640418的深红红 螺菌菌株序列相似性为 96%。13 ing和 2C序列相似 性为 97% ,而 2c与序列号为 BX571966的沼泽红假 单胞菌的序列相似性仅为 91%。 8株菌 16S rDNA序 列直接在 nr中 B las,t结果 8株菌与种属完全不同菌 株序列相似性达 97%以上: 菌株 G a、rub与种属完全 不同序列号为 AY346141、AY346138、AY346140和 AY548384产碱菌序列相似性均为 98% ; 菌株 13 ing 与序列号为 AY346138、AY346141和 AY346140产碱 菌序列相似性分别为 98%、97%和 98% ;菌株 MT与 441中国微生态学杂志 2010年 5月第 22卷第 5期 序列号为 AY346138产碱菌序列相似性为 99% ;菌株 WS8N 与 序 列 号 为 AY346138、 AY346141 和 AY346140产碱菌序列相似性分别为 99%、98% 和 98%;菌株 2c与序列号为 AY186083(来源于环境样 品中非培养细菌 ) , 序列号为 AB114621(非培养肠细 菌 ) ,序列号为 AF025369(肠细菌 )序列相似性均为 98% ;菌株 Il106与序列号为 AJ536678、A J536682和 A J536683细菌序列相似性均为 99%。 表 2 8株 PSB菌株生理生化实验结果 项目 G a Il106 W S8N 2c 2C 13 ing rub MT1131 碳 源 乙酸钠 + + + + + + + + 丙酮酸 - - - + + + + + L�谷氨酸钠 + + + + + + + + 柠檬酸钠 + + + + + + - - 丁二酸钠 + + + + + + + + 苹果酸钠 + + + + + + + + 乳酸钠 + + + + 甲酸钠 - - - + + + - - 果糖 + + + + + + + + 葡萄糖 + + + + + + + + 甲醇 - - - - - - - - 乙醇 + + + + + + + - 硫代硫酸钠 - - - + + + - 氮 源 蛋白胨 + + + + + + + + 硫酸铵 + + + + + + + + 硝酸铵 + - + + + + + - 硝酸钾 + - + + + + + - 亚硝酸钾 - - - - - - + - 生 长 因 子 VB1 + + + + + + + + 生物素 + + + + + + + + 对氨基苯甲酸 - - - + + + - + 尼克酸 + + + - - - - + 淀粉 + + + + + + + + 吐温 60 + + + + + + + + 明胶 - - - + - - - - 触酶实验 + + + + + + + + 甘油 + + + + + + - - 注: & + ∋表示利用、需要或反应阳性; & - ∋表示不利用或不是生长因子;空格表示未做。 表 3 菌株类胡萝卜素溶于 3种不同溶剂中的特征吸收波长 ( nm ) 菌株 溶剂石油醚 CS2 CH C l3 13 ing 446, 473, 502 507, 539 458, 489, 515 rub 445, 471, 501 510, 544 313, 485, 515 WS8N 445, 472, 502 509, 539 308, 485, 515 Ga 445, 472, 501 505, 539 456, 485, 517 I l106 445, 471, 501 505, 543 455, 485, 516 MT1131 445, 472, 501 505, 540 458, 486, 516 2c 445, 470, 501 504, 538 457, 485, 515 2C 445, 471, 501 504, 539 460, 485, 516 442 Chinese Journal ofM icroeco logy, M ay�2010, Vo l�22N o�5 基于菌株 16S DNA序列的系统进化树 (图 1)显 示,同一种菌并不总是聚为一簇,但相隔较近; 种属完 全不同的菌株,尽管序列相似性高达 97%以上, 在系 统进化树上相隔较远。 注:每条枝上的数据表示 1000次重复建树过程中该枝出现的百分率, 细菌名称后小括号里的数字是对应菌株在 GenBank中的序列号。标 尺表示 5%的序列差异。 图 1 基于 16S DNA序列的系统发育树 3 讨论 从菌株鉴定结果分析,菌株 2C、2c和 13 ing为革 兰阴性菌, 菌体杆状。细胞含有特征性菌绿素 和 类胡萝卜素,主要醌类是 CoQ10,能利用柠檬酸钠、硫 代硫酸钠,生长因子是生物素和对氨基苯甲酸, 酵母 膏对其生长有刺激作用,以上特征是沼泽红假单胞菌 所特有。G a、Il106和 WS8N 3株菌符合类球红细菌 特点, MT1131与荚膜红细菌特征相符, rub与深红红 螺菌特征吻合,根据上述形态和生理生化特征, 参照 (伯杰氏系统细菌学手册) (第 9版 )和东秀珠等编著 的 (常见细菌系统鉴定手册 ) (第 1版 ) , 认为菌株 2C、2c和 13 ing为沼泽红假单胞菌,菌株 Ga、Il106和 WS8N为类球红细菌, MT1131为荚膜红细菌, rub为 深红红螺菌。 8株 PSB菌株的 16S DNA序列在 nr中进行 B last 时,发现序列相似性达到 98%甚至 99%的菌株可能 完全属于不同的种属, 而同一种属的菌株序列相似性 有的只有 86%。在系统进化树上也发现同一种菌并 不都聚成一簇,但种属关系较远的菌株尽管序列相似 性高达 98%或 99%, 在进化树上却相隔较远。可见 对菌株进行 16S DNA序列分析时不能单纯以 B last 结果直接下结论, 而是要结合菌株常规鉴定及系统进 化树综合分析才能客观准确。B�CKHED等也认为 菌株间 16SDNA序列的相似性达 95%就判为同一属 菌,相似性达 98%就定为同一种菌比较武断, 而且不 准确 [ 8]。 8株 PSB菌株的鉴定和系统进化关系分析结果 为后续研究提供了背景资料, 同时菌株在 GenBank 中获得的 16S DNA序列的序列号为菌株作上了生物 标记,为菌株的产权保护提供了依据。 �参考文献� [ 1 ]曾宇,秦松,梁明山.先合细菌综合应用新进展 [ J] . 水产科学, 2000, 19 ( 5) : 34�36. [ 2 ]钱新民,刘扬,任凌云.采用生物统计方法优化光合细菌产类胡萝 卜素条件的研究 [ J] .山东大学学报 (自然科学版 ) , 1993, 28( 10 ) : 118�119. [ 3 ]顾青,梁新乐, 励建荣. 光合细菌 R1发酵产类胡萝卜素的研究 [ J] .食品与发酵工业, 2001, 27( 10) : 24�28. [ 4 ]平山修.光合细菌�色素 [ J] .发酵�工业, 1978, 36 ( 7) : 563�573. [ 5 ]王根华,钱和,肖刚.发酵菌体中辅酶 Q10的提取及其测定方法 [ J] .无锡轻工大学学报, 2003, 22( 2 ): 59�62. [ 6 ]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册 [M ] .北京:科学出版社, 2001: 349�399. [ 7 ]张成岗,贺福初.生物信息学方法与实践 [M ] .北京:科学出版社, 2002: 38�49. [ 8 ] B� CKHED F, LEY R E, SONNENBURG J L, et a.l H ost�BacterialM u� tual ism in the Hum an Intestin e [ J ] . S cience, 2005, 307 ( 577 ) : 1915�1920. �其 他 � 图书信息 (中国微生态学杂志)编辑部现装有从创刊年 ( 1989年 )至 2009年的全套合订本杂志,此外还保存有康白 教授等国内知名微生态学专家撰写的书籍: (微生态学原理 )、(肠内世界纪行)、(双歧杆菌)、(肠内菌群与微 生态调节剂 )、(微生态学研究)、(新抗微生物战略), 以及往届的全国微生态学学术研讨会 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 集 (五、六、七、 八届 )。上述资料,如有需要,请来电联系。 联系人:李兵 电话: 0411�84787163 地 址:大连市旅顺南路西段 9号 中国微生态学杂志编辑部 ( 116044) 443中国微生态学杂志 2010年 5月第 22卷第 5期