壳聚糖酶菌株的筛选鉴定和产酶条件研究毕业论文

毕 业 论 文（设计） 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 目： 产壳聚糖酶海洋微生物菌株的筛 选、鉴定与产酶条件研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 班 级： 指导教师： 起止日期： 2011年 月 日—2012年 月 日 2012年 4 月 30 日 目录 工贸企业有限空间作业目录特种设备作业人员作业种类与目录特种设备作业人员目录1类医疗器械目录高值医用耗材参考目录 I中文摘要 IIAbstract 1引言 31 实验材料和方法 31.1 主要仪器与设备 31.2 实验药品和试剂 41.3 实验方法 51.4 实验步骤 92 结果与分析 92.1 富集培养与平板筛选 92.2 菌株KJT-A鉴定和分析 122.3 菌株KJT-D鉴定与分析 142.4 菌株KJT-A的生长情况 152.5 菌株KJT-D的生长情况 162.6 假单胞菌株KJT-A壳聚糖酶的分离 172.7 GF1-4的SDS-PAGE检测 193 小结与讨论 193.1 产壳聚糖酶海洋微生物菌株的筛选 193.2 产壳聚糖酶菌株的鉴定 203.3 温度与盐度对产壳聚糖酶菌株生长的影响 203.4 壳聚糖粗酶的制备和纯化 224 结论 23参考文献： 26附录Ⅰ 28附录Ⅱ 30附译文 34附译文原文 38致 谢 产壳聚糖酶海洋微生物菌株的筛选、鉴定与产酶条件研究 [摘要] 采用不同培养基对舟山旭旺养殖厂海水养殖环境样品进行壳聚糖酶产生菌的分离，结果表明海水培养基对于菌株筛选有显著的促进作用，同时甲壳类外壳是壳聚糖酶产生菌的良好来源。KJT-A和KJT-D是从海水养殖场蟹壳表面分离到的两株壳聚糖酶产生菌株，结合形态学观察、生理生化反应和分子生物学鉴定，初步确定菌株KJT-A和KJT-D分别为假单胞菌属（Pseudomonas）和青霉属（Penicillium）。分析不同温度、盐度对两株菌株生长的影响，发现KJT-A是一株中度嗜盐菌，最适生长温度为19℃，在48h时达到最大吸光值；KJT-D是一株广盐性菌株，最适生长温度为28 ℃，在72h时达到最大吸光值。两株菌株在普通海水盐度条件下均能很好生长，这有利于菌株的海水发酵，对于节约淡水资源有着极大的作用。同时对上述两株菌株所产壳聚糖酶进行分离纯化和相关性质研究，可以进一步了解其分子结构与盐度适应性的相关性，为壳聚糖酶的基础研究提供理论参考。 [关键词] 壳聚糖酶；鉴定；16S rDNA；假单胞菌；青霉 Screening and Identification of Chitosan-Hydrolytic Microorganisms From Marine Environment and Study on the Optimal Conditions of Chitosanase Formation [Abstract] In this paper the chitosanase-producing microbes from the marine environment were studied. The result showed that sea water medium can significantly improve isolation of strain,and the surface of crab shell was best source of chitonsanase-producing bacterial strain. KJT-A and KJT-D, which were isolated from the crab shell surface of xuwang mariculture zone in zhoushan island, were classified into Pseudomonas and Penicillium based on morphology, physiology, biochemistry and molecular biology methods.Exploring the growth of two strains in different temperature and salinity ,we found that KJT-A is a moderately halophilic bacteria,the optimum temperature is 19℃,achieving the maximum absorbance when cultured 48h.KJT-D is a widesalt-resistant strains,the optimum temperature is 28℃,achieving the maximum absorbance at 72h.The two strains can grow well in the normal salinity condition,this is helpful to the sea strains fermentation,and have a great effect to save the freshwater resources.Chitosanase of the above two strains were isolated and purified,which help us have a better understanding of its molecular structure and salinity adaptation,and provide a theoretical reference for the basic research of the chitosanase. [Key words] chitosanase; identification; 16S rDNA; Pseudomonas; Penicillium 引言 人类己进入21世纪，随着人们生活水平的不断提高，人们的健康意识越来越强，希望通过各种途径促进自己的身体健康，服用保健品便是其中的途径之一[1]。壳聚糖是由氨基葡萄糖通过β-1，4键连接而成的天然线性高聚物[2]。它是一种含氮多糖类天然活性物质，对人体有十分重要的生理功能，1991年国际甲壳素大会上其被确定为人体所必需的除糖、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质以外的第六生命要素。壳聚糖能溶于稀酸中，但也需要通过人体中的壳聚糖酶等的作用，经转化为低糖后才能被人体吸收，这大大限制了它们的功效[3]。近年来，随着研究的深入，人们发现壳聚糖经水解生成的壳寡聚糖不仅其溶解度大幅提高，易于被人体吸收利用，而且还具有抗肿瘤、抗菌免疫激活以及保湿吸湿等许多独特的生理活性，其在医药、保健品方面的应用令人瞩目[4, REF _Ref324532120 \r \h \* MERGEFORMAT 5]。 目前降解壳聚糖获得壳寡糖的方法主要有化学降解法和酶降解法。化学降解法是工业化生产中最早、最常用的方法，主要有酸降解法和氧化降解法。酸降解法一般是用HCl、HF使壳聚糖主链发生水解，(β-1，4)糖苷键断裂。水解产物可为氨基葡萄糖及其衍生物或各种低分子量的多聚糖，但这种方法对产品的聚合度不好控制。氧化降解法采用的是HNO2，过硼酸钠和亚硝酸盐等试剂将壳聚糖的(β-1，4)糖苷键氧化而断裂，得到的主要是四糖以下的低聚物，但氧化法会引起部分反应产物的结构变化，由于化学降解法反应条件十分苛刻、难以控制、反应的稳定性和重复性较差、后处理繁琐、消耗大量的浓酸和浓碱，造成环境污染，不易得到低聚糖，因此温和、高效、水解过程和产物分布容易控制、无污染的生物酶法成为研究的热点[6]。 生物酶法是利用自然界中的生物产生的壳聚糖酶和其他一些酶来降解壳聚糖产生壳寡糖。其中壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)是可以降解壳聚糖的一种专一性水解酶，主要作用于氨基葡萄糖单体之间的(β-1，4)一糖苷键连接。因此，对壳聚糖酶的研究是酶法降解壳聚糖制备壳寡糖研究中的中心内容之一[7, REF _Ref324532155 \r \h \* MERGEFORMAT 8]。 壳聚糖酶广泛存在于细菌、真菌以及植物体的生长代谢过程当中。胞外壳聚糖酶绝大多数来源于细菌和真菌；而胞内壳聚糖酶主要来自于植物细胞中，并且参与细胞壁的构建与修饰。壳聚糖酶大多是诱导酶，在菌体正常的生长代谢过程中不合成或仅仅少量合成，但在诱导物壳聚糖存在的条件下会大量合成[9, REF _Ref324532179 \r \h \* MERGEFORMAT 10]。 目前，利用生物酶法降解壳聚糖制备壳寡糖的研究大多数还处在实验室研究阶段，关键问题是难以获得大量的专一性的壳聚糖酶制剂，而采用非专一性酶降解壳聚糖的效果又不够理想。虽然经过30多年的研究，己经从上述多种微生物中分离出壳聚糖酶，但因其产酶能力都较低，使壳聚糖酶的生产成本过高，价格昂贵，难以实现商业化应用。因此，要采用酶解的方法实现壳寡糖的规模化生产，充分利用和开发丰富的壳聚糖资源，除了利用基因工程或诱变手段提高现有壳聚糖酶产量外，还要寻求新的专一性的高活性壳聚糖酶来源，并对其理化性质及应用进行研究[11, REF _Ref324532199 \r \h \* MERGEFORMAT 12]。 海洋中蕴涵了大量的甲壳素资源，在长期的能量代谢、循环利用以及生物进化过程中，势必会产生许多独特的降解甲壳素的海洋微生物，因此在海洋环境中筛选高产壳聚糖酶的微生物菌株，为生物酶法降解壳聚糖，生产壳寡糖提供理论依据和实用方法，这对于更好的利用我省丰富的甲壳素资源，开发附加值高的壳寡糖系列产品，促进我省甲壳素行业健康发展有着重要的现实意义[13]。本文从浙江舟山海水养殖环境中进行壳聚糖酶产生菌的筛选，分离到2株产壳聚糖酶活力高的菌株，并从形态、生理生化特征和16S rDNA 序列等方面对菌株进行了鉴定。 1 实验材料和方法 1.1 主要仪器与设备 培养皿：直径90mm， 中国医药（集团）上海化学试剂公司 锥形瓶：容量100mL，150mL，250mL，500mL，国药集团上海化学试剂公司 烧杯：容量100mL，500mL，1000mL，国药集团化学试剂有限公司 量筒：容量50mL，100mL，1000mL，国药集团化学试剂公司 电子天平：BS124S型，塞多利斯科学仪器（北京）有限公司 精密天平：PL203-S型， 梅特勒－托利多中国地区 立式压力蒸汽灭菌锅：YXQ-LS-50A型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 干燥培养箱：PH0702A型，上海一恒科学仪器有限公司 隔水式恒温培养箱：GHP9720型，上海一恒科学仪器有限公司 恒温摇床培养箱：ZHWY-2102C型，上海智城分析仪器制造有限公司 冷冻离心机：Eppendorf 5417R型，艾本德中国有限公司 数显水浴锅：DKS-16型，上海经济区沈荡中新电器厂 垂直流超净工作台：ZHJH-C1115C型，上海智城分析仪器制造有限公司 低速离心机：LD5-2A型，北京医用离心机厂 分光光度计：722S型，上海精密科学仪器有限公司 冰箱西门子：BCD-226型，博西华家电器有限公司 移液器：QY-1000A型，北京青云卓立精密仪器设备有限公司 凝胶成像系统：GEL DOCTM XR+型，BIO-RAD Laboratories公司 液相色谱仪：waters 600E型，Waters公司 高速冷冻离心机：CF16RXII型，Hitachi Koki公司 基因扩增仪：PE-9700型，Applied Biosystems公司 低压电泳仪：DYY-6C型，北京市六一仪器厂 冷干与离心浓缩系统：Labconco Freezon型，Labconco公司 照相机：Nikon 4500 1.2 实验药品和试剂 1.2.1 常规药品（购于国药集团上海化学试剂公司） 蛋白胨，牛肉膏，琼脂，NaCl，壳聚糖，酵母粉，MgSO4·7H2O，KCl，CaCl2，K2HPO4·3H2O，KH2PO4，葡萄糖，NaOH，浓盐酸，酒石酸钾钠，3，5-二硝基水杨酸，柠檬酸，亚硫酸钠，N-乙酰D-葡萄糖胺，重蒸酚，硫酸铵，乙醇，过硫酸铵 1.2.2 主要生化试剂（盒） 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司 TaKaRa Taq：宝生物工程（大连）有限公司 Tris-Tricine SDS-PAGE电泳试剂盒：北京天恩泽基因科技有限公司 1.3 实验方法 1.3.1 制备培养基 除特殊说明外，以下实验所用的水是海水：蒸馏水体积比=3：1配制而成。 胶体壳聚糖的配制 1g壳聚糖中加入30ml的0.4mol/l HCl，搅拌至壳聚糖完全溶解，用2mol/l NaOH调pH至5.0，加水定容至100ml，配成1%的胶体壳聚糖。 胶体壳聚糖平板 A液：1%胶体壳聚糖； B液：K2HPO4·3H2O 0.4%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.14%，NaCl 0.1%, KCl 0.1%，CaCl2 0.02%，酵母粉 0.1%，琼脂 3%，pH 7.0； A，B液分别121℃灭菌20min后等体积混合，倒平板。 胶体壳聚糖液体培养基 A液：1%胶体壳聚糖； C液：K2HPO4·3H2O 0.14%，KH2PO4 0.06%，MgSO4·7H2O 0.1%，蛋白胨 0.03%，酵母粉 0.06%，pH 7.0； A液和C液等体积混合，121℃灭菌20min。 1.3.2 制备试剂 DNS试剂 45.5g酒石酸钾钠加至125ml热水中，搅拌溶解后加入1.575g的3，5-二硝基水杨酸（DNS）和65.5ml的2mol/L NaOH，再加入1.25g重蒸酚和1.25g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，用蒸馏水定容至250ml，储存在棕色瓶中，一周后可使用。 N-乙酰D-葡萄糖胺 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 液 准确称取0.442g，用蒸馏水定容至1000ml，配成2mmol/l的标准液。 McIlvaine缓冲液 0.2mol/lNa2HPO4-0.1mol/l柠檬酸缓冲液，两者按36.4:13.6的体积比混合配成pH=6.6的缓冲液。 1.3.3 采样位点 采样点选择在浙江省舟山市小沙镇的旭旺养殖厂。 1.4 实验步骤 1.4.1 富集培养与平板第一次筛选 将泥样等的水洗液1ml加至含0.2g壳聚糖的10ml的0.2%K2HPO4溶液中，30℃下富集培养7天，再采用平板稀释法在胶体壳聚糖平板上均匀涂布10-3、10-4、10-5稀释度的富集培养液，平板于30℃恒温箱中培养，不时观察菌落生长情况和菌落周围的水解透明圈产生情况。培养4天后挑取生长良好且能产生透明圈的单菌落，接至胶体壳聚糖斜面培养基上保存[14]。 1.4.2 平板第二次筛选 将挑选出的各菌落用无菌牙签点接至胶体壳聚糖平板上，30℃恒温箱培养。各平板的厚度大致相同，每个平板上点接3株菌，做两组平行。培养4天后取出平板，测量各菌落直径的大小（d）和各菌落周围相应的透明圈的大小（D），以D/d比值和d值为指标挑选产壳聚糖酶能力强的菌株。 1.4.3 摇瓶复筛 将平板初筛所得的各菌株分别接至2ml胶体壳聚糖液体培养基中，30℃，130rpm预培养18h后，取1ml接至装在150ml三角瓶中的50ml胶体壳聚糖液体培养基中，30℃、130rpm培养9天后取样各发酵液的酶活力。结合平板第二次筛选的结果，挑取酶活力最高的菌株作为进一步研究的产酶试验菌。 1.4.4 发酵液壳聚糖酶活力的测定 制作N-乙酰D-葡萄糖胺标准曲线 分别取2mmol/l的N-乙酰D-葡萄糖胺标准液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ml于试管中，均用蒸馏水补足10ml，混匀；各取0.5ml和0.5mlDNS试剂混合后沸水浴中加热5min，迅速用冷水冷却，每管中加4ml蒸馏水，混匀后以蒸馏水为对照，于540nm波长处读取吸光度值。另外取0.5ml蒸馏水和0，5mlDNS试剂混合，经同样处理后也以蒸馏水为对照测OD540，作为空白。每种浓度的溶液作两个平行，结果取平均值。以N-乙酰D-葡萄糖胺量（mmol/L）为横坐标，以不同浓度的N-乙酰D-葡萄糖胺溶液的OD540与空白OD540的差值为纵坐标做标准曲线，并由该曲线的趋势线获得标准曲线函数。 测定壳聚糖酶活力 发酵液于4000rmp离心15min，取上清液作为酶液，按图1.1方法检测其活力。 根据N-乙酰D-葡萄糖胺标准曲线，将两组OD540差值折算成还原糖量，比较酶活力。 图1.1 壳聚糖酶活力的测定方法 Fig. 1.1 the assay method of enzyme activity 1.4.5 产壳聚糖酶菌的鉴定 形态学特征 根据D/d值和酶活的大小选择两株菌（KJT-A、KJT-D）进行后续研究。将菌株KJT-A和KJT-D接种在胶体壳聚糖平板培养基上，30℃恒温培养48~72 h，观察菌落形态，挑取单菌落进行常规显微观察和测定[15]。 细菌菌株生理生化反应 按照伯杰氏细菌鉴定手册进行试验[16]，并结合API自动微生物鉴定系统进行判读，记录反应结果。 16S rDNA序列测定和分析 分别利用细菌16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)、1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)，真菌18S rDNA引物NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS4(5’-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’)进行PCR扩增，反应体系50 μL：其中DNA模板5 μL，PCR premix 25 μL，正反向引物各0.5 μL，ddH2O 19 μL。PCR条件：94℃预变性5 min；94℃变性1min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物回收后送大连宝生物测序。序列提交GenBank，并利用Blastn进行相似性搜索，Clustal X进行多序列比对，Mega 4.0绘制进化树。 1.4.6 培养温度对产壳聚糖酶菌生长的影响 培养温度对细菌生长的影响 500ml三角瓶中装入200ml壳聚糖液体培养基，挑取一环新鲜细菌斜面种子接入培养基，分别在10℃、19℃、27℃、38℃下130rpm振荡培养，每隔24h取发酵液，以蒸馏水为对照，测各上清液600nm处的吸光度值（OD600）。必要时对各发酵液进行适当倍数的稀释。 培养温度对真菌生长的影响 配制50 mL的发酵培养基10瓶，分别按3%的接种量将种子培养基接入发酵培养基中，分别在10℃、19℃、27℃、38℃下以130rpm的转速振荡培养，每隔24 h取一瓶培养液，经离心和洗涤后，菌体烘干至恒重，测定菌体干重[17]。 1.4.7 培养基盐度对产壳聚糖酶菌生长的影响 培养基盐度对细菌生长的影响 根据海水：蒸馏水的不同比例，配制盐度分别为1%、2%、3%和5%的壳聚糖液体培养基，分别挑取一环新鲜斜面种子接入培养基，在28℃温度下130rpm摇床培养。每隔24h取发酵液，以蒸馏水为对照，测各上清液600nm处的吸光度值（OD600）。 培养基盐度对真菌生长的影响 根据海水：蒸馏水的不同比例，配制10瓶50ml盐度分别为0.5%、1%、2%、3%和5%的壳聚糖液体培养基，分别按3%的接种量将种子培养基接入发酵培养基中，在28℃下以130rpm的转速培养，每隔24h取一瓶培养液，经离心和洗涤后，菌体烘干至恒重，测定菌体干重。需注意的是培养和操作条件必须完全相同。 1.4.8 硫酸铵分级沉淀产壳聚糖酶菌蛋白 取离心上清液，量筒量出体积，按照比例进行实验，依次加硫酸铵的量为20%，50%，80%。例如1L壳聚糖酶上清液首次需缓慢加106g硫酸铵，不能一次性加入使局部浓度过高。0℃冰箱放置过夜后，10000×g，离心5min，分离沉淀和上清，再次缓慢加入175g硫酸铵，0℃冰箱放置过夜后，10000×g，离心5min，分离沉淀和上清，同样做80%硫酸铵沉淀。将沉淀置于-80℃结冻，再放到冷冻干燥机冻干待用。 1.4.9 产壳聚糖酶菌壳聚糖酶的分离 采用高效液相色谱对粗提壳聚糖酶样品进行分离纯化，所有分离步骤均在Waters 600E型高效液相色谱仪上完成，检测器为Waters 2487型紫外检测器，检测波长为280nm。分别取粗提样品，用0.45µm针头过滤器过滤，上样高压分子筛柱Sepax-100Å（7.8×300mm，Sepax公司）采用去离子水洗脱，流速为0.75ml/min，收集各洗脱峰，经冷冻干燥后待用。 1.4.10 壳聚糖酶活性检测 取分子筛后分离样品，分别配置0.1，0.5，0.8，1.0mg/mL浓度的样品，用打孔法对分离样品的酶活性进行检测，去离子水为对照，30℃正面放置培养箱过夜。观察其壳聚糖水解圈有无以及大小，初步估计其酶活性大小。 1.4.11 分离样品的SDS-PAGE电泳鉴定 采用Tris-Tricine SDS-PAGE电泳试剂盒进行壳聚糖酶的分子量初步检测，其操作按照试剂盒说明书进行。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶配制方法为：浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为10%， pH8.9的Tris-甘氨酸缓冲液。样品与2×加样缓冲液等体积混合后沸水浴加热3分钟，1000rpm离心1分钟，以20pL/孔的加样量进行电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色显示电泳条带。根据电泳结果判断酶的纯度并对照已知分子量的标准蛋白Marker得出壳聚糖酶的分子量。 2 结果与分析 2.1 富集培养与平板筛选 通过富集培养，稀释分离，观察到1天后即有26株能够产生水解圈的菌落生长，挑取生长良好且能产生透明圈的单菌落，编号并转接至胶体壳聚糖斜面培养基中保存，共得到9株生长状况良好且能产生水解圈的菌株，对其透明圈直径(D)和菌落直径(d)值进行测量，其结果如下表2.1。综合D/d值以及液体培养基摇瓶试验的酶活数据，选取菌株KJT-A和KJT-D作为进一步研究的试验菌株。 图2.1 胶体壳聚糖平板初筛情况 Fig. 2.1 The condition of preliminary screening on the chitosan flat plate 表2.1 9株菌产壳聚糖酶能力的比较 Tab.2.1 The comparison of chitosanase producing capability in nine strains 菌株编号 D/d 酶活力//U/mL 菌株编号 D/d 酶活力//U/mL KJT-A 7.50 0.852 KJT-F 6.00 0.532 KJT-B 7.00 0.760 KJT-G 4.00 0.344 KJT-C 7.20 0.632 KJT-H 8.00 0.728 KJT-D 10.67 0.960 KJT-I 3.33 0.236 KJT-E 6.33 0.540 2.2 菌株KJT-A鉴定和分析 2.2.1 形态学和生理生化鉴定结果 光镜下可见菌株KJT-A成直杆或弯杆状，菌体大小0.6~1.5×1.8~3.0 μm，革兰氏阴性（图2.3），有鞭毛，无芽孢，无荚膜，不产色素，在固体培养基上菌落为圆形，白色半透明，微隆起，边缘较光滑。生理生化反应结果如表2.2所示，参照《伯杰细菌鉴定手册》[15]和《常见细菌系统鉴定手册》[16]的描述，菌株KJT-A与假单胞菌属（Pseudomonas sp.）分类特征相符。 图2.2菌株 KJT-A的形态学图片 Fig. 2.2 Morphology of strain KTT-A 图2.3菌株KJT-A的革兰氏染色（油镜100×10） Fig. 2.3 KJT-A Gram stain(Oil 100x10) 表2.2 菌株KJT-A的常规生理生化反应特征 Tab.1.2 Tradition taxonomical properties of stain KJT-A 鉴定项目 鉴定结果 鉴定项目 鉴定结果 鉴定项目 鉴定结果 氧化酶 ＋ 柠檬酸盐利用 ＋ 甲烷利用 － 接触酶 ＋ 淀粉水解 ＋ 甲醇利用 NO 酯酶 － 葡萄糖产酸，产气 － 甲基胺利用 － 明胶水解 ＋ D-葡萄糖利用 ＋ a-氨基戊酸盐 － 硝酸盐还原试验 － D-果糖利用 － a-酮基葡萄糖酸盐 ＋ β－半乳糖苷酶 － 蔗糖利用 ＋ β-羟基丁酸盐 ＋ 精氨酸双水解酶 － 甘露醇利用 ＋ 奎宁酸盐 － 赖氨酸脱羧酶 － 鼠李糖利用 － DL-苹果酸 ＋ 鸟氨酸脱羧酶 － 密二糖利用 － 肌氨酸 － 色氨酸脱氨酶 － 阿拉伯糖利用 ＋ L-酪氨酸 ＋ 脲酶 － 异丁醇利用 ＋ 吐温-80 ＋ VP试验 － 山梨醇利用 － 硫代硫酸钠 － 吲哚试验 － 肌醇利用 － 苦杏仁苷 － M.R试验 － 甘油利用 ＋ 注: “+” 为阳性，“ – ”为阴性,”NO”为未检出. 2.2.2 16S rDNA序列分析 使用细菌通用引物27F和1492R对KJT-A 16S rDNA基因进行PCR扩增，反应完成后，以DL2000 DNA marker作为标准的分子量标记，对PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检验，其凝胶图像如图2.4所示。 图2.4 KJT-A 和KJT-D基因扩增电泳 Fig. 2.4 The amplification of 16S rDNA and 18S rDNA gene in agarose gel 序列分析结果表明，菌株KJT-A的16S rDNA序列全长为1440 bp，(G+C)%为52.3%。NCBI搜索出20个相似度大于97%的菌株序列用于系统进化树的构建（图2.5），从建立的系统发育树中可以看出，菌株KJT-A属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.），与居海假单胞菌（Pseudomonas marincola strain SI85-2B）的亲缘关系最近。该菌株的16S rDNA序列已提交Genbank，登录号为JN974879。 关于假单胞菌属（Pseudomonas）产壳聚糖酶已有较多报道，如Pseudomonas sp. ww[18]、Pseudomonas sp. A3[19]、Pseudomonas sp. IZ208[20]、Pseudomonas sp. TUC13[21]、Pseudomonas sp. TKU008[22]、Pseudomonas sp. TKU015[23]、P.aeruginosa K-187[24]、P.stutzeri Y4[25]、Pseudomonas sp. A-01[26]、Pseudomonas sp.VⅢT39[27]、Pseudomonas sp. H3[28]、Pseudomonas sp. Y8[29]等，但来自海洋环境的假单胞菌不多，本研究所筛选的KJT-A与筛选自加拿大Saanich海湾[30]的居海假单胞菌（Pseudomonas marincola SI85-2B）亲缘关系最近，这为壳聚糖酶纯化提供新的菌株来源。 图2.5 菌株KJT-A部分16S rDNA序列的系统进化树 Fig. 2.5 The evolutionary tree base on sequence of 16S rDNA 2.3 菌株KJT-D鉴定与分析 2.3.1 形态学鉴定结果 菌株KJT-D在PDA培养基上生长较快，50-55 h就可长出菌落，培养7 d后菌落直径为45 mm。菌落形状为圆形，边缘锯齿状，菌落干燥，有明显灰绿色的气生菌丝，早期颜色偏淡，后随培养时间延长渐渐加深，中间的颜色较深，逐渐向边缘延伸变浅，正、背面相差不大。菌丝分布不均匀，中央气生菌丝较多，成茸状，向上生长。菌丝与培养基粘的不紧密，容易挑取。 在25℃培养14 h即可观察到孢子的萌发、产生菌丝体、形成分生孢子梗和产孢结构，显微镜下可见无色细长分支、分隔菌丝、直立的分生孢子梗、顶端单轮生帚状枝及大量柱状或分散柱状排列的椭圆形、近球形小分生孢子（图2.7）。参照相关文献[31, REF _Ref324533615 \r \h \* MERGEFORMAT 32]，初步鉴定为青霉属。 图2.6 菌株KJT-D的形态学图片 Fig. 2.6 Morphology of strain KTT-D 图2.7 菌株KJT-D的显微图片(400x) Fig. 2.7 Micro-graph of strain KJT-D (400x) 2.3.2 18 S rDNA序列分析 使用真菌通用引物NS1和NS4对KJT-D 18S rDNA基因进行PCR扩增，反应完成后，以DL2000 DNA marker作为标准的分子量标记，对PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检验，其凝胶图像如上图2.4所示。 序列分析结果表明，菌株KJT-D的18S rDNA序列全长为1085 bp，NCBI共搜索出13个相似度大于98%的结果，构建系统进化树如图2.8所示，从中可以看出，菌株KJT-D属于青霉属（Penicillium sp.），与青霉菌株（Penicillium sp. MI 31）的亲缘关系最近。该菌株的18S rDNA序列已提交Genbank，登录号为JN974880。 真菌是壳聚糖酶的重要产生菌株，已有Penicillium sp.ZD-Z1[33]、Penicillium sp. D-1[34]、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）[35]、岛青霉(Penicillium islandicum) [36]、小刺青霉菌（Penicillium spinulosum）[37]等多株青霉属菌株产壳聚糖酶的报道。但海洋来源、产壳聚糖酶的青霉研究还比较欠缺，仅见草酸青霉（Penicillium oxalicum）产壳聚糖酶的报道[38]，本实验所筛选的青霉KJT-D作为海洋真菌，其壳聚糖酶的性质值得进一步深入研究。 图2.8菌株KJT-D部分18S rDNA序列的系统进化树 Fig. 2.8 The phylogenetic tree base on sequence of 18S rDNA 2.4 菌株KJT-A的生长情况 2.4.1 温度对菌株生长的影响 不同温度下假单胞菌菌株KJT-A的生长情况见图2.9所示。菌株KJT-A的最适生长温度是19 ℃，在48 h达到最大吸光值，在28℃条件下生长情况也较好。在低温（10℃）和高温（37℃）下仍可以生长，但生长速度较慢（分别在72 h和84 h达到最大吸光值），菌液密度也较低。 图2.9不同温度对假单胞菌菌株KJT-A生长的影响 Fig. 2.9 The growth effect of strain Pseudomonas sp KJT-A in different temperature 2.4.2 盐度对菌株生长的影响 不同盐度下假单胞菌菌株KJT-A的生长情况见图2.10。菌株KJT-A在4个试验盐度下均能生长，但在5％NaCl浓度的培养基中生长情况最好，菌体浓度在72 h达到最大吸光值。菌株KJT-A在1-3％NaCl浓度的培养基中菌体浓度与5%NaCl浓度相比要小，说明假单胞菌菌株KJT-A是一株中度嗜盐菌。 图2.10 不同盐度对假单胞菌菌株KJT-A生长的影响 Fig. 2.10 The growth effect of strain Pseudomonas sp KJT-A in different salinity 2.5 菌株KJT-D的生长情况 2.5.1 温度对菌株生长的影响 不同温度下青霉菌株KJT-D的生长情况见图2.11所示。菌株KJT-D的最适生长温度是28℃，在72 h菌体达到最大干重值；在19℃和37℃条件下，菌株KJT-D的最大菌体干重值基本相同，只是37℃的生长速度更快（60 h达到最大干重值），而19℃条件下青霉菌株在72 h才达到最大菌体干重值。在低温（10℃）下青霉菌株KJT-D仍可以生长，但生长速度非常缓慢，菌液密度也很低。 图2.11 不同温度对菌株KJT-D生长的影响 Fig. 2.11 The growth effect of strain Penicillium sp KJT-D in different temperature 2.5.2 盐度对菌株生长的影响 不同盐度下青霉菌株KJT-D的生长情况见图2.12。菌株KJT-D在0.5%-5% NaCl这5个试验盐度下菌体生长情况基本类似，但在0.5％NaCl浓度时菌体生长速度略快，说明青霉菌株KJT-D是一株广盐性菌株，但在低盐度情况下生长更好。 图2.12不同盐度对青霉菌株KJT-D生长的影响 Fig. 2.12 The growth effect of strain Penicillium sp KJT-D in different salinity 由于图中不能看出5个浓度之间的显著差异，再对盐度对菌株生长的影响进行单因素方差分析（表2.3）。因为P=0.983918>0.05，差异不显著，则说明不同盐浓度下的菌体干重时间变化无显著性差异。说明盐度对KJT-D生长的影响不明显。 表2.3 盐度对KJT-D生长的单因素方差分析 Tab.2.3 single factor analysis of variance of salinity on the KJT-D growth 组 观测数 求和 平均 方差 0.005 8 2.98 0.3725 0.0221 0.01 8 2.7 0.3375 0.0179 0.02 8 2.82 0.3525 0.0206 0.03 8 2.85 0.3563 0.0234 0.05 8 2.66 0.3325 0.0245 差异源 SS df MS F P-value F crit 组间 0.0081 4 0.0020 0.0934 0.9839 2.6414 组内 0.7598 35 0.0217 总计 0.7679 39 2.6 假单胞菌株KJT-A壳聚糖酶的分离 冷冻离心得到KJT-A培养液的上清液，进行硫酸铵分级沉淀，发现低浓度硫酸铵时得到大量沉淀，随着溶液浓度增加，沉淀量逐步减少，最后获得四个不同浓度沉淀，分别冷冻干燥后进行分子筛。分子筛分离得到GF1-4四个馏分（图2.13），分别收集，将每次收集到的同类样品合并冷冻干燥。 图2.13壳聚糖酶沉淀样品经Sepax-100Å分子筛分离的图谱，以去离子水为洗脱液，共收集4个洗脱峰，分别命名为GF1~4 Fig. 2.13 Sepax-100Å gel filtration of peptide. Eluting solvent，double distilled water; flow rate， 0.75mL/min; column， 7.8×300mm ;fractions collected is labeled from GF1 to GF4. 2.7 GF1-4的SDS-PAGE检测 样品GF1-4分别加缓冲液95℃变性10min后，点样进行SDS-PAGE电泳，如图2.14显示，只有GF2在4000-5000Da的范围有条带显示。取GF2样品，经测量，发现其没有酶活性。且通常壳聚糖酶的分子从21-69kDa不等[39] REF _Ref324533627 \r \h \* MERGEFORMAT [40]，目前还没有发现21kDa以下的壳聚糖酶分子，因而推测此成分不是壳聚糖酶同源物，后续实验未能继续。 图2.14 GF1-GF4各洗脱峰的Tris-Tricine SDS-PAGE电泳检测图谱。（只有GF2有蛋白质成分显示） Fig. 2.14 Tris-Tricine SDS-PAGE of the fractions GF1 to GF4.（Only GF2 has protein component displayed） 3 小结与讨论 3.1 产壳聚糖酶海洋微生物菌株的筛选 取样方面，因为壳聚糖广泛存在于水生甲壳类动物、软件动物和节肢动物的外壳中，所以我们主要集中在虾蟹养殖场及其周边自然环境中取样。本实验利用以壳聚糖作为唯一碳源和氮源的培养基进行富集培养，从而限制其他微生物的生长。富集培养后，用平板稀释法分离微生物，即利用以胶体壳聚糖作为唯一碳氮源的平板培养基稀释分离富集培养液中的微生物菌株。微生物利用壳聚糖后，因壳聚糖的降解和利用，会在其菌落周围形成一个透明圈，且其产壳聚糖酶活性越高，降解利用壳聚糖能力越大，所产生的透明圈相对来说就越大。大体上说，D/d值越大，其酶活力也就越大，但也有例外，这主要是因为除了测量中的仪器误差外，如果细菌生长的不好，菌落小的话可导致D/d值偏大。因此D/d值对于菌株产壳聚糖酶活性，只能是参考，不能以此为根据[41, REF _Ref324533634 \r \h \* MERGEFORMAT 42]。 检查某种酶的含量常用它催化某一特定反应的能力来表示，即用酶活力来表示。本实验中，我们采用在一定时间内，在一定的缓冲液环境中，酶液与底物壳聚糖在一定温度下反应，通过测定反应体系中新产生的还原糖（壳寡糖）量的多少来确定壳聚糖酶活力的大小。产生的还原糖越多，酶活力越高[18]。 壳聚糖酶产生菌株的来源主要集中在土壤[8]，水环境[9]和食品[10]，近年来海洋生物与环境成为筛选壳聚糖酶产生菌的新来源，包括沿海环境样品，如浙江沿海城市及海水养殖区的土壤和水样[11, REF _Ref324532199 \r \h \* MERGEFORMAT 12]]等沿海城市海水和泥样等[18]，因此海洋环境样品将是未来筛选高产壳聚糖酶微生物的重要来源。 尽管这一套筛选产壳聚糖酶菌的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 完整可靠，仍然有许多不完善之处。首先，在培养方面，由于自然环境中甲壳类物质的降解过程一般是在厌氧的环境中进行的，因而可尝试在厌氧条件下进行筛选。其次，在复筛过程中，测定壳聚糖酶活力的方法过于繁琐，应尝试探索出一种更简便的方法[44]。 3.2 产壳聚糖酶菌株的鉴定 一般来讲， 微生物的鉴定技术依不同水平分为4 个方面。（1）微生物细胞形态与生活习性。如观察微生物形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件等。（2）细胞组分。进行细胞组分成分，如细胞壁成分、脂类、醌类、细胞氨基酸库、色素等的分析。采用的技术包括化学，光谱、色谱和质谱分析等技术。（3）蛋白质。采用氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等技术分析细胞蛋白质。（4） 基因。包括核酸分子杂交( DNA 与DNA或DNA 与RNA)， G+C moL% 含量测定，遗传信息转化和传导， 16S rRNA ( 核糖体RNA) 寡聚核苷酸组分分析， 及 DNA 或RNA 的核苷酸序列分析。随着分子生物学技术的发展， 蛋白质与基因水平的鉴定方法逐渐成为微生物鉴定的主要手段， 其鉴定结果更具有说服力。目前， 对于海洋微生物的鉴定研究也以该水平上的鉴定方法为主[45-47]。 为了确定目标菌株的分类地位，我们对菌株KJT-A和KJT-D进行了一系列形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析鉴定。结果表明，这几种方法的鉴定结果完全一致，可以起到相辅相成的效果，为我们培养菌株和研究其进化地位提供了依据。研究得到，其中菌株KJT-A经鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp），其菌株归属为Bacteria， Protebacteria， Gammaproteobacteria， Pseudomonadales， Pseudomonadaceae， Pseudomonas（细菌域，变形菌门，γ-变形菌纲，假半胞菌目，假单胞菌科，假单胞菌属）。菌株KJT-D经鉴定为青霉属（Penicillium sp）。目前，来自海洋的、产壳聚糖酶的假单胞菌和青霉菌并不多见，这就为壳聚糖酶纯化提供了新的菌株来源。 3.3 温度与盐度对产壳聚糖酶菌株生长的影响 由于本研究的目标发酵产物是壳聚糖酶和壳寡糖，而不是菌体，因此我们主要是要通过研究提高菌株产壳聚糖酶的能力，并设法得到这些酶。壳聚糖酶广泛存在于自然界的微生物中，但野生型菌株产酶量往往不高，缺少应用价值。从这点出发，研究其发酵培养条件发现：KJT-A是一株中度嗜盐菌，最适生长温度为19℃；KJT-D是一株广盐性菌株，最适生长温度为28℃。两株菌株在普通海水盐度条件下均能很好生长，这为未来利用海水直接发酵提供了基础，不仅可以降低在菌株生长过程中添加相关必需微量元素的成本，同时也可以节约发酵所需的淡水资源，有着良好的应用前景。 同时，培养基中壳聚糖底物量、摇瓶装量、接种量、培养液PH等对菌体产酶均会产生影响[9, REF _Ref324532433 \r \h \* MERGEFORMAT 18, REF _Ref324533628 \r \h \* MERGEFORMAT 41, REF _Ref324533637 \r \h \* MERGEFORMAT 44]。对发酵液酶活力的测定可发现，菌株产酶量随着培养时间先快速上升后反而下降，且培养基中壳聚糖的量多有利于菌体生长而不利于菌体产酶。据此可推断菌体的生长和产酶不是同步进行的，刚开始培养基中没有直接可利用的碳源和氮源，菌体在受壳聚糖的诱导下立即产生大量的壳聚糖酶，酶将壳聚糖降解成壳寡糖或氨基葡萄糖供菌体大量生长，未被消耗掉的还原糖量积累到一定程度后便抑制了壳聚糖酶的产生，使发酵后期发酵液的酶活力降至较低水平。这正是一个典型的分解代谢物阻遏现象。 3.4 壳聚糖粗酶的制备和纯化 真菌源壳聚糖酶和细菌来源的壳聚糖酶在基因上没有同源性，从产壳聚糖酶的微生物种类上看，真菌的数目较其它微生物更多。目前真菌源壳聚糖酶的分离纯化还较少，国内外主要己经研究了假单胞菌属[28, 39]、青霉属[33, REF _Ref324533618 \r \h \* MERGEFORMAT 34]和球孢白僵菌[48]等种类，主要集中在以诱变产壳聚糖酶的野生型菌株，使之提高产酶能力等方面。在实验中发现，KJT-D菌落生长致密，在10000×g的冷冻高速离心条件下仍不能沉淀，且超声波对菌株没有影响，只能采取过滤法对菌株和菌液进行分离，这也为真菌源壳聚糖酶的分离纯化增加了难度。 作为微生物产生的壳聚糖酶可以分为胞内酶和胞外酶两种。经过细胞破碎后测酶活的方法，证明KJT-A和KJT-D产生的壳聚糖酶均为胞外酶。基于此实验事实，我们通过离心，硫酸铵分级盐析、超滤脱盐和冷冻干燥等方法，得到壳聚糖粗酶液，以便于进一步研究。 在加硫酸铵的过程中发现，加至20%饱和度时，有大量沉淀及絮状物产生，该絮状物经收集并重新溶解后，再对其测定酶活力，发现该絮状沉淀没有酶活力。因而可以确定此沉淀物为杂志，可能组分为杂蛋白、菌体代谢物或部分没有完全被菌体所消耗的壳聚糖。 对于蛋白质和酶等大分子生物分子的纯化，已经有了一套比较成熟的实验程序。一般采用离子交换层析和凝胶过滤层析相结合，再经电泳检测的方法，可以得到较纯的物质[39]。本研究中，基于以上指导思想，采用Sepax-100Å分子筛，得到了较纯的壳聚糖酶，经SDS-PAGE电泳进行检测，得到约4100Da的条带。检测该成分发现没有酶活性，且一般壳聚糖酶的分子量均为20kDa以上，至今还未发现小分子量的壳聚糖酶。重复该实验时，发现该蛋白不稳定存在。因而推测，该成分有可能为杂蛋白。 4 结论 1、与其他文献提到的菌株相比，我们实验中筛选到的KJT-A和KJT-D的生长速度相对较快KJT-A菌株在45-50h达到生长的最高峰，KJT-D菌株在50-55h达到最大生长值。其中青霉属菌株的产酶能力较强，具有菌株诱变及发酵培养的前景。 2、在实验中，我们改变胶体壳聚糖液体培养基的盐度、菌株摇床培养的温度，分别测定KJT-A和KJT-D的生长情况。结果发现，KJT-A是一株中度嗜盐菌，最适生长温度为19℃；菌株KJT-D是一株广盐性菌株，最适生长温度为28℃。但是两株菌株在普通海水盐度条件下均能很好生长，这为未来利用海水直接发酵提供了基础，不仅可以降低在菌株生长过程中添加相关必需微量元素的成本，同时也可以节约发酵所需的淡水资源，有着良好的应用前景。 3、国内关于壳聚糖酶的研究较少，已发现的产壳聚糖酶菌株多数为假单胞菌属和球孢白僵菌，关于海洋产壳聚糖酶菌株的研究更是稀少。但是海洋微生物种类繁多，适应能力强，具有极大的开发前景。本实验从舟山海水养殖场虾蟹壳表面分离到两株高产壳聚糖酶海洋微生物，鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp）和青霉属（Penicillium sp）菌株，这为生物酶法降解壳聚糖，为生产壳寡糖，为充分利用甲壳素资源提供理论依据和方法。同时可对这两株菌所产壳聚糖酶进行分离纯化和相关性质的研究，从而为壳聚糖酶的基础研究提供理论参考。 参考文献： [1] 蒋挺大. 甲壳素[M]北京:化学工业出版社, 2003:7-18. 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[48] 方祥年, 杜昱光, 黄秀梨, 等. 球孢白僵菌高产壳聚糖酶突变株的筛选[J]. 微生物学通报, 2001, 28(3):60-64. 附录Ⅰ 附表1 不同盐度对假单胞菌菌株KJT-A生长的影响 A.Tab 1 The growth effect of strain Pseudomonas sp KJT-A in different salinity 时间（h） 1% 2% 3% 4% 12 0.5 0.579 0.329 0.126 24 0.51 0.561 0.453 0.503 36 0.536 0.576 0.458 0.588 48 0.549 0.584 0.447 0.695 60 0.557 0.592 0.438 0.754 72 0.567 0.59 0.456 0.773 84 0.545 0.582 0.439 0.751 96 0.529 0.57 0.431 0.738 108 0.55 0.46 0.558 0.738 120 0.563 0.585 0.45 0.742 注：KJT-A测量为在相同条件下测OD600. 附表2不同温度对假单胞菌菌株KJT-A生长的影响 A.Tab 2 The growth effect of strain Pseudomonas sp KJT-A in different temperature 时间（h） 19℃ 28℃ 37℃ 12 0.232 0.411 0.37 24 0.596 0.558 0.533 36 0.674 0.603 0.567 48 0.823 0.723 0.61 60 0.745 0.684 0.685 72 0.762 0.705 0.712 84 0.731 0.7 0.686 96 0.713 0.616 0.643 108 0.703 0.612 0.662 120 0.594 0.546 0.523 附表3不同盐度对菌株KJT-D生长的影响 A.Tab 3 The growth effect of strain Penicillium sp KJT-D in different salinity 时间（h） 0.5% 1% 2% 3% 5% 12 0.09 0.08 0.09 0.07 0.09 24 0.24 0.21 0.21 0.18 0.12 36 0.33 0.32 0.3 0.34 0.29 48 0.4 0.37 0.41 0.43 0.4 60 0.42 0.37 0.39 0.42 0.35 72 0.47 0.41 0.44 0.45 0.43 84 0.48 0.46 0.46 0.45 0.46 96 0.55 0.48 0.52 0.51 0.52 注：KJT-D菌株测量为每50ml培养液中接入1环，培养后测量菌体干重。 附表4不同温度对菌株KJT-D生长的影响 A.Tab 4 The growth effect of strain Penicillium sp KJT-D in different temperature 时间（h） 10℃ 19℃ 28℃ 37℃ 12 0.07 0.07 0.13 0.15 24 0.08 0.12 0.18 0.22 36 0.07 0.1 0.24 0.28 48 0.07 0.16 0.44 0.42 60 0.15 0.25 0.41 0.53 72 0.14 0.46 0.71 0.41 84 0.15 0.48 0.58 0.41 96 0.14 0.52 0.59 0.46 108 0.23 0.48 0.57 0.41 附表5硫酸铵沉淀蛋白质配比表 A.Tab 5 Anount of Ammonium sulfate required for protein precipitation Percentage saluration at 0℃ Initial concentration of ammonium sulfate 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Solid ammonium sulfate (grams) to be added to 1 liter of solution 0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 559 603 650 697 5 79 108 137 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 526 570 615 662 10 53 81 109 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 493 536 581 627 15 26 54 82 111 141 172 204 237 271 306 343 381 420 460 503 547 592 20 0 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 427 469 512 557 25 0 27 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 395 436 478 522 30 0 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 362 402 445 448 35 0 28 57 87 118 151 184 218 254 291 329 369 410 453 40 0 29 58 89 120 153 187 222 258 296 335 376 418 45 0 29 59 90 123 156 190 226 263 302 342 383 50 0 30 60 92 125 159 194 230 268 308 348 55 0 30 61 93 127 161 197 235 273 313 60 0 31 62 95 129 164 201 239 279 65 0 31 63 97 132 168 205 244 70 0 32 65 99 134 171 209 75 0 32 66 101 137 174 80 0 33 67 103 139 85 0 34 68 105 90 0 34 70 95 0 35 100 0 附录Ⅱ 1、 细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司） 1). 取细菌培养液1ml，10000rpm离心1分钟，吸净上清液； 2). 向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮； 3). 向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混匀； 4). 加入220μl缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以除去管盖内壁的水珠； 5). 加220μl无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以除去管盖内壁的水珠； 6). 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 7). 向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液CD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 8). 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中； 9). 向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 10). 将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； 11). 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加150μl洗脱缓冲液ＴＥ，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中（为增加DNA得率，重复该步骤）。 2、 Tris-Tricine SDS-PAGE电泳试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司） 将2块干净的玻璃板和2个0.75 mm的隔条，组装玻璃平板夹层，并将其固定在灌胶支架上；根据平板的面积、需要制备的胶的厚度，估计需要配制的分离胶（seperating gel）和浓缩胶（stacking gel）的体积。 第一步，配置配制分离胶。A）：新鲜配制10%的APS（过硫酸铵）：按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL超纯水的比例将水加到装有硫酸铵干粉的1.5mL EP管中，摇晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周。B）：在一个25mL的三角瓶中，先按下表的用量加入水、40%丙烯酰胺溶液和4×分离胶缓冲液。下表为配制10 mL胶的用量。 C）：摇晃混匀后抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除将影响丙烯酰胺聚合反应）。D）：将50uL新鲜配制的10%过硫酸铵溶液和10uL TEMED溶液加入到溶液中，轻轻旋转混匀。E)：灌胶。用一根巴斯德吸管，将分离胶溶液沿着一条隔条的边缘加到玻璃板夹层中，直到玻璃板之间溶液的高度约为11cm。F）：用另一根巴斯德吸管，先从一侧的隔条边缘，再从另一侧的隔条边缘缓慢的往凝胶的顶部加入一层水饱和的异丁醇（厚约1cm），让凝胶在室温聚合30-60min。G）：倾去异丁醇，用1×Tricine-SDS-PAGE制胶缓冲液彻底冲洗后，待用。 表 10mL分离胶配置 Tab. Separation Gel 试剂 用量 40%丙烯酰胺溶液（19:1） 7.50mL Tricine-SDS-PAGE制胶缓冲液，3× 10.00mL 50%甘油 3.17mL（4.00g） 1.25H2O 9.33mL 合计 30mL 第二步，配置4%浓缩胶。A）：在一个50mL的三角瓶中，先按下表的用量加入水、40%丙烯酰胺溶液和Tricine-SDS-PAGE制胶缓冲液。下表为配制12.5 mL胶的用量。 B）: 摇晃混匀后抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除将影响丙烯酰胺聚合反应）。C）: 将50uL新鲜配制的 10%的过硫化铵溶液和10uL TEMED溶液加入到溶液中，轻轻旋转混匀。D）: 灌胶。用巴斯德吸管，将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条的边缘加到玻璃板夹层中，直到玻璃板夹层中的溶液高度离玻璃板顶部约1cm高为止。小心不要产生气泡。E）: 插入0.75mm厚的塑料梳子，再补加浓缩胶溶液填满梳子间的空隙，仍然注意避免产生气泡。让浓缩胶在室温聚合30-60分钟（低温抑制聚合反应）。小心拔出梳子，避免撕裂凝胶加样孔。用阴极缓冲液冲洗并加满加样孔。在电泳装置的下层缓冲液槽中加入阳极缓冲液用浓盐酸调pH 到8.9（25℃）即得10×阳极缓冲液，灭菌后可以4℃放置，用时再用水稀释成1×阳极缓冲液。安装电泳装置，并根据厂商说明书固定上层缓冲槽。在上层缓冲槽中加入部分阴极缓冲液（产品提供10 升的阴极缓冲液干粉，将所有干粉溶解在1000mL 水中即得10×阴极缓冲液，可以室温放置，不需要灭菌，用时再用水稀释成1×阴极缓冲液。）至覆盖加样孔为止。在密封的螺盖微量离心管中，用2×Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液按1：1的比例稀释蛋白样品，于100℃煮沸3-5 min。 表 12.5mL4%浓缩胶的配置 Tab. stacking gel of 12.5mL 用量（单位：mL） 总体积（mL） 水 40%丙烯酰胺 Tricine-SDS-PAGE制胶缓冲液,3× 7.08 1.25 4.17 12.5 如果样品是蛋白沉淀物，加入50-100 uL 新配的1×Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液溶解；如果样品是蛋白稀溶液，可考虑先浓缩蛋白质。注：用考马斯亮蓝染色时，对于成分复杂的蛋白质混合物，0.8 cm宽的加样孔的加样体积不超过20 uL（25-50 uL总蛋白质）为宜，对于只有一种或几种蛋白质的样品，只需1-10 uL的总蛋白质。采用银染时，样品用量可减少10-100倍。为了得到均一的条带，配制蛋白质样品时，浓度和等体积要相同。在加入Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液前后，要将样品一直放于冰上。含Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液的样品，如未经100℃加热灭活蛋白酶之前，切勿将其放于室温。 第三步，进行连续电泳。电泳时，先在30 V恒压下电泳1 h（对0.75mm×14cm×14cm 的胶而言），接着在150 V恒压下电泳4-5 h。注：本产品的Tricine-SDS-PAGE上样液使用了考马斯亮蓝G-250作为指示剂，其泳动速度比最小的肽还快。终止电泳，取出凝胶进行后续的染色处理。 一株木糖氧化产碱菌几丁质酶的分离纯化和性质研究 Rajiv Vaidya, Satarupa Roy, Simone Macmil, Sapan Gandhi, Pranav Vyas & H.S. Chhatpar 巴罗达大学 生命科学院 微生物学和生物技术中心 印度古吉拉特邦 390002 通讯作者（传真：+862652792508;电子邮箱：chhatparhs@yahoo.co.in） 收到日期：2003年1月31日/修改：2003年2月5日/接受：2003年3月7日/ 在线出版： 2003年3月7日 关键词：木糖氧化产碱菌，黑曲霉，几丁质酶，纯化 摘要：利用凝胶过滤亲和层析的方法从一株木糖氧化产碱菌胞外分离得到几丁质酶，并且电泳检测纯度较高。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤测定该几丁质酶的分子量分别约为45KDa和44KDa，该酶在50℃（超过30分钟）和PH为5时具有最大活性，并具有稳定单一的凝胶电泳条带。酶动力学常数Km为3g/L。Cu2+和Na+的浓度为5mM时即可抑制几丁质酶的活性至其最大值的25%，而在相同浓度下，Ca2+、Mg2+和Ba2+对酶活没有影响。纯化的酶可以降解黑曲霉菌丝。 引言 甲壳素是节肢动物、腔肠动物和真菌的主要结构多糖。它是由N-乙酰葡萄糖胺以β-1,4糖苷键连结而成的生物大分子结构，通过几丁质酶的水解作用降解成为单糖。分解几丁质的酶包括几丁质酶(EC3.2.1.14)和N-乙酰葡糖胺糖苷酶(EC3.2.1.52)。几丁质酶作为真菌抑制剂极具有开发潜力（Patil等，2000）。本文介绍了一种分离自木糖氧化产碱菌的几丁质酶，并研究了它的纯化方法和相关酶学性质。 1 材料和方法 本实验所使用的菌体、培养材料和介质均来自木糖氧化产碱菌IMI No. 385022，这是我们从海洋食品加工企业的工业废水中分离得到的，已经通过英国CAB的鉴定。它的培养条件为：每公升培养基中加入5g壳寡糖粉末、0.5g酵母提取液、1g(NH4)2SO4、0.3gMgSO4.7H2O和1.36g KH2PO4。而几丁质和几丁质酶的制备和测定方法与早期描述的相同（Vaidya等，2001）。 表1.从Alc.xylosoxydans 中分离几丁质酶 实验步骤 总体积/mL 总活性/units 总蛋白/mg 比活/units·mg-1 纯化指数 得率/% 粗提液 100 2624 36 73 – – 几丁质亲和物纯化 90 106 12 90 1.2 40 超滤 3 999 11 90 1.2 38 凝胶过滤 6 192 1 178 2.4 7 电泳割胶 几丁质亲和物的纯化方式是等体积混合培养液滤液和1%酸处理几丁质溶液，0-5℃静置1h。然后11000×g离心20min，弃去上清液中的蛋白质，再用50mM醋酸钠缓冲液（pH=5）等体积洗脱沉淀，再用2倍醋酸钠缓冲液体积洗脱沉淀，接着37℃摇床3h以使几丁质酶充分溶解，11000×g再次离心20min，弃去上清。几丁质亲和物通过超滤仪（超滤仪8050，10kDa 滤膜）去除，得到纯净的产物用凝胶过滤方式纯化，过Sephadex G-75柱（1.2×29cm），用含有100mM KCl 的50mM Tris-HCl，pH=7.5洗脱，流速为0.6mL•min-1。 2 纯化酶的特征 2.1SDS-PAGE 使用8% (v/v)的SDS-PAGE对该酶进行分子量测定（Sambrook等，1989）。 2.2活性染色 我们在Trudel和Asselin(1989)的实验基础上稍作修改，电泳用的聚丙烯酰胺(8% v/v)含有0.01% (w/v)乙二醇几丁质。将电泳后的凝胶置于0.1M的醋酸钠缓冲液（PH=5）中在37±2℃的条件下浸泡24小时以除去其中的SDS，其中Triton X-100的含量为1％（V/V）。凝胶用蒸馏水洗涤，另外在37±2℃放置12小时以确保乙二醇几丁质和几丁质酶充分反应。凝胶染色后用0.01％（W/V）的Calcofluor White M2R（美国Sigma公司）在0.5 M Tris HCl缓冲液（pH=8.9）中浸泡2小时，然后在室温下用蒸馏水脱色2小时后放在紫外光下检测，发现几丁质酶出现暗色条带。 2.3金属离子的影响 将金属离子(5 mM)和纯化酶一起在0–5℃中温育15分钟，接着在标准检测条件下测定残余酶活力。 2.4氨基端氨基酸测序 几丁质酶在SDS-PAGE电泳之后，将聚丙烯氨酰胺凝胶与聚二氟乙烯膜一起放到含25mM Tris-HCl和20%（v/v）甲醇溶液的迷你转膜器（Bangalore Genei, India）中孵育30min，蛋白质就从凝胶上转到PVDF膜上，PVDF膜在0.15%（w/v）的考马斯亮蓝R-250溶液（含体积比甲醇：醋酸：蒸馏水=40：10：50）中显色4h，在脱色剂（含体积比甲醇：醋酸：蒸馏水=40：10：50）中脱色，收集染色的蛋白质条带用多肽测序仪（Shimadzu型 PPSQ-10）分析。这个测序系统包括Edman反应盒，在线的PTH分析软件和CR-7A数据库（孟买印度理工学院，国际蛋白质测序设备）。 3、结果与讨论 3.1几丁质酶的分离纯化 几丁质酶最终纯化2.4倍，产率是7%（见表1）。图1显示了最后凝胶过滤的结果。纯化后的几丁质酶活性为一条直线（未显示在图中）。Nawani和Kapadnis在2001年发表一篇论文，用硫酸铵沉淀和Sephadex G-100凝胶过滤分离出5.1倍纯化效率的几丁质酶。 图1 经Sephadex G-75凝胶过滤的几丁质酶 3.2几丁质酶的性质 3.2.1分子质量 从Alc. xylosoxydans中分离的几丁质酶与同源物通过SDS-PAGE可以观察到，其分子质量分布在44kDa~45kDa，从B .circulans中分离的几丁质酶分子质量是45kDa（Wiwat et al.1999），从Serratia marcescens中分离到57kDa几丁质酶（Nawani & Kapadnis 2001），从Trichoderma harzianum Rifai T24中分离到43kDa几丁质酶（El-Katatny et al.2000）。 3.2.2最适pH值和最适温度 通常酶活性最高时的温度是50℃（超过30min），pH值是5.0。而从Bacillus sp.中分离的几丁质酶的活性pH和温度范围为7.5-9.0和45℃-55℃（Bhushan & Hoondal 1998）。 3.2.3金属离子对几丁质酶活性的影响 在5mM Cu2+或Na+浓度下25%的酶活性被抑制，而相同浓度的Ca2+，Ba2+或Mg2+环境下酶活性不被抑制。从Serratia plymuthica中分离的几丁质酶在有Ca2+环境下活性提高20%，而在Cu2+环境下80%的活性被抑制（Frankowski et al.2001）。Mg2+和Na+能抑制Pseudomonas aeruginosa中的几丁质酶50%的活性，而Cu2+则可使其活性提高50%（Wang & Chang 1997）。Mg2+可使Penicillium janthinellum中分离的几丁质酶活性提高28%（Giambattista et al.2001）。 3.2.4酶动力学研究 纯净的几丁质酶对酸处理几丁质的酶活力常数Km值是3g•L-1。早期有报导T. harzianum Rifai T24中分离的几丁质酶Km值为3.8g•L-1（El-Katatny et al.2001）和Enterobacter aerogenes中分离的几丁质酶Km值为2.9g•L-1（Tang et al.2001）。 3.2.5几丁质酶的N端序列 研究发现N端有精氨酸（D），亮氨酸（L），脯氨酸（P），谷氨酸（E）和苯丙氨酸（F）等。 3.2.6对真菌生长的抑制作用 早期的研究（Vaidya et al.2001）表明Alcaligenes xylosoxydans的培养液滤液对真菌Fusarium udum和Rhizoctonia bataticola的生长有很高的抑制活性。由此证明几丁质酶化合物是一种重要的抗真菌活性剂，还做了纯净的几丁质酶对真菌菌丝体的分解作用的实验。从Alc. xylsosoxydans中分离的纯几丁质酶对菌丝的分解及Asp. niger的孢子萌发都有抑制作用（数据未给出）。从Penicillium janthinellum P9中分离的几丁质酶可造成Mucor plumbeus和Cladosporium cladosporioides的菌丝体损伤（Giambattista et al.2001）。从Fusarium chlamydosporum中分离的几丁质酶可溶解Puccinia arachidis的孢子壁和萌发管（Mathivanan et al.1998）。因此，我们的研究表明Alc. xylosoxydans产生几丁质酶并使真菌细胞壁分解。 参考文献： [1] Bhushan B, Hoondal GS (1998) Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase form an alkalophilic Bacillus sp.BG-11.Biotechnol.Lett.2:157–159. [2] El-Katatny MH ,Gudelj M, Robra K-H, Elnaghy MA, Gubitz GM (2001) Characterization of a chitinase and an endo-β-1,3-glucanase from Trichoderma harzianum Rifai T24 involved in control of the phytopathogen Sclerotium rolfsii. Appl. Microbiol. Biotechnol.56:137–143. [3] Frankowski J, Lorito M, Scala F, Schmid R, Berg G, Bahl H (2001) Purification and properties of two chitinolytic enzymes of Serratia plymuthica HRO-C48.Arch.Microbiol.176:421–426. [4] Giambattista RD, Federici F, Petruccioli M, Fenice M (2001) The chitinolytic activity of Penicillium janthinellum P9:purification, partial characterization and potential applications.J.Appl. Microbiol.91:498–505. [5] Mathivanan N, Kabilan V, Murugesan K(1998) Purification, characterization and antifungal activity from Fusarium chlamydosporum, a mycoparasite to groundnut rust, Puccinia arachidis. Can.J.Microbiol.44:646–651. [6] Patil RS, Ghormade V, Deshpande MV (2000) Chitinolytic enzymes: an exploration. Enzyme Microb. Technol.26:473–483. [7] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edn. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press. ISBN 0-87969-309-6. [8] Tang Y, Zhao J, Ding S, Liu S, Yang Z (2001) Purification and property of chitinase from Enterobacter aerogenes. Weishengwu Xuebao41: 82–86. [9] Trudel J, Asselin A (1989) Detection of chitinase activity after polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem.178:362–366. [10] Vaidya RJ, Shah IM, Vyas PR, Chhatpar HS (2001) Production of chitinase and its optimization from a novel isolate Alcaligenes xylosoxydans:potential in antifungal biocontrol. World J. Microbiol. Biotechnol.17:691–696. [11] Wiwat C, Siwayaprahm P, Bhumiratana A (1999) Purification and characterization of chitinase from Bacillus circulans No. 4.1.Curr. Microbiol.39:134–140. 致谢 我们真诚的感谢印度巴罗达GSFC科学基金会对我们提供的资金支持，以及孟买印度理工学院A.K.Lala博士为我们提供N端氨基酸序列！ Purification and characterization of chitinase from Alcaligenes xylosoxydans Rajiv Vaidya, Satarupa Roy, Simone Macmil, Sapan Gandhi, Pranav Vyas & H.S. Chhatpar﹡ Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, M.S. University of Baroda, Vadodara-390 002, Gujarat, India Author for correspondence (Fax: +91 265 2792508; E-mail: chhatparhs@yahoo.co.in) Received 31 January 2003; Revisions requested 5 February 2003; Revisions received 7 March 2003; Accepted 7 March 2003 Key words: Alcaligenes xylosoxydans, Aspergillus niger, chitinase, purification Abstract Extracellular chitinase from Alcaligenes xylosoxydans was purified to electrophoretic homogeneity using affinity and gel filtration chromatography. The molecular mass of chitinase was estimated to be 45 kDa and 44 kDa by SDS-PAGE and gel-filtration, respectively. The enzyme was optimally active at 50 ℃ (over 30 min) and pH 5. Activity staining after PAGE showed a single band. The Km for chitin was 3 g l−1. Cu2+ and Na+ at 5 mM inhibited chitinase activity to 25% while Ca2+, Mg2+ and Ba2+ had no effect at the same concentration. The purified enzyme degraded mycelia of Aspergillus niger. Introduction Chitin is the major structural polysaccharide of arthropods, coelenterates and fungi. It is a biopolymer of β-1,4-linked N-acetylglucosamine. It is hydrolyzed to its monomeric constituents by the action of chitinolytic enzymes. Chitinolytic enzymes comprise of chitinase (EC 3.2.1.14) and N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.52). Chitinases have potential as antifungal control agents (Patil et al. 2000). We report here purification and characterization of an extracellular chitinase from Alcaligenes xylosoxydans. Methods and materials Organism, culture conditions and medium used Alcaligenes xylosoxydans IMI No. 385022, which we have isolated from seafood industrial waste, was identified by CAB International, Surrrey, UK. It was grown in a medium containing (per litre): 5 g chitin, 0.5 g yeast extract, 1 g (NH4)2SO4, 0.3 g MgSO4 · 7H2O and 1.36 g KH2 PO4. Preparation of acid-swollen chitin and chitinase assay methods were same as described earlier (Vaidya et al. 2001). Characterization of purified enzyme SDS-PAGE. The molecular mass was estimated by SDS-PAGE using 8% (v/v) gel as described by Sambrook et al. (1989). Activity staining. Activity staining was done as described by Trudel & Asselin (1989) with slight modifications. Polyacrylamide (8% v/v) gel containing 0.01% (w/v) ethylene glycol chitin was used for electrophoresis. After electrophoresis the gel was incubated at 37 ± 2 ℃ for 24 h in 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5) containing 1% (v/v) Triton X-100 to remove SDS. The gel was washed with distilled water and incubated for an additional 12 h at 37 ± 2 ℃ for reaction of chitinase with ethylene glycol chitin. Gel staining was followed with 0.01% (w/v) Calcofluor White M2R (Sigma, USA) in 0.5M Tris HCl (pH 8.9) buffer for 2 h. Destaining was performed with distilled water for 2 h at room temperature. The chitinase band appeared as dark band under u.v. transillumination. Effect of metal ions. Metal ions (5 mM) were preincubated with enzyme at 0–5 ℃ for 15 min and the residual chitinase activity was assayed under standard assay condition. Table 1. Purification of chitinase from Alc. xylosoxydans. Step Total Volume (ml) Total activity (units) Total protein (mg) Specific activity (units mg−1 protein) Purification (fold) Recovery (%) Crude 100 2624 36 73 – – Chitin affinity 90 106 12 90 1.2 40 Ultrafiltraion 3 999 11 90 1.2 38 Sephadex G-75 6 192 1 178 2.4 7 Gel filtration Chitin affinity was performed by mixing equal volume of culture filtrate and 1% acid-swollen chitin and incubated at 0–5 ℃ for 1 h. This mixture was then centrifuged at 11 000× g for 20 min, to remove unadsorbed proteins. After washing the pellet in equal volume of 50 mMsodium acetate buffer (pH 5), it was resuspended in half the volume of the same buffer, followed by incubation for 3 h at 37 ℃ with shaking for the release of the enzyme from chitin. The enzyme suspension was then centrifuged at 11 000 × g for 20 min to remove particulate matter. The clear supernatant obtained from chitin affinity was concentrated by ultrafiltration (Amicon 8050, 10 kDa cutoff membrane) and applied to a Sephadex G-75 column (1.2×29 cm) equilibrated with 50 mM Tris HCl, pH 7.5 containing 100 mM KCl at a flow rate of 0.6 ml min−1. Determination of NH2-terminal amino acid sequence. After SDS-PAGE of the purified chitinase, the polyacrylamide gel and PVDF membrane were incubated for 30 min in blotting buffer containing 25 mM Tris HCl, and 20% (v/v) methanol. The protein was then transferred from polyacrylamide gel to PVDF membrane using a Mini Transfer-Blotting apparatus (Bangalore Genei, India). The blotted PVDF membrane was stained in 0.15% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 in methanol/acetic acid/water (40:10:50, by vol.) for 4 h and destained in the destaining solution [methanol/acetic acid/water (40:10:50, by vol.)]. The stained protein band was analyzed with peptide sequencer (Shimadzu model PPSQ-10). The system consists of an Edman reaction unit, an on-line PTHanalyzer and a CR-7A data processor (National facility for Protein Sequencing, Indian Institute of Technology, Powai, Mumbai). Results and discussion Purification of chitinase Chitinase was purified 2.4-fold with 7% recovery (see Table 1). The purification by the final gel filtration step is shown in Figure 1. Activity staining of purified chitinase showed a single band (data not shown). A 5.1-fold purification of chitinase was reported from Serratia marcescens NK1 by Nawani & Kapadnis (2001) with ammonium sulphate precipitation and Sephadex G-100 gel filtration. Fig. 1. Purificaton of chitinase by Sephadex G-75 gel filtration. Characterization of purified chitinase Molecular mass. The chitinase from Alc. xylosoxydans was purified to homogeneity as observed by SDS-PAGE. The molecular mass of the purified chitinase was determined to be 44 kDa and 45 kDa by SDS-PAGE and gel filtration, respectively. The molecular weight of chitinase from B. circulans was 45 kDa (Wiwat et al. 1999), 57 kDa from Serratia marcescens (Nawani & Kapadnis 2001) and 43 kDa from Trichoderma harzianum Rifai T24 (El-Katatny et al. 2000). Optimum pH and temperature optima. The enzyme was optimally active at 50℃ (over 30 min) and pH 5. Chitinase from Bacillus sp. showed broad pH and temperature optima of 7.5–9 and 45℃–55 ℃ respectively (Bhushan & Hoondal 1998). Effect of metal ions on chitinase activity. The enzyme was inhibited 25% by Cu2+ and Na+ at 5 mM but not by Ca2+, Ba2+ or Mg2+ at the same concentration. In Serratia plymuthica chitinase was activated by 20% by Ca2+, while Cu2+ caused 80% inhibition (Frankowski et al. 2001). In Pseudomonas aeruginosa Mg2+ and Na+ were inhibitory while Cu2+ activated the chitinase by 50% (Wang & Chang 1997). Mg2+ activated the chitinase of Penicillium janthinellum by 28% (Giambattista et al. 2001). Enzyme kinetics. With acid-swollen chitin, the purified chitinase gave Km of 3 g l−1. The Km values for chitinase reported earlier were: 3.8 g l−1 for chitin in T. harzianum Rifai T24 (El-Katatny et al. 2001) and 2.9 g l−1 for chitin in Enterobacter aerogenes (Tang et al. 2001). N-terminal sequence of chitinase. The N-terminal sequence was found to be aspartate (D), leucine (L), proline (P), glutamate (E) and phenylalanine (F). Fungal growth inhibition. Our earlier studies (Vaidya et al. 2001) showed inhibition of the growth of Fusarium udum and Rhizoctonia bataticola by culture filtrates of Alcaligenes xylosoxydans which had high chitinase activity. To substantiate that it is chitinase component which is important for anti fungal activity, attempts were made to see the effect of purified chitinase on fungal mycelial degradation. Purified chitinase from Alc. xylsosoxydans inhibited hyphal degradation and spore germination in Asp. niger (data not shown). Chitinolytic enzymes from Penicillium janthinellum P9 caused mycelial damage in Mucor plumbeus and Cladosporium cladosporioides (Giambattista et al. 2001). Purified chitinase from Fusarium chlamydosporum lysed the walls of uredospores and germ tubes of Puccinia arachidis (Mathivanan et al. 1998). Our studies thus indicate that Alc. xylosoxydans produces chitinase and causes fungal cell wall degradation. Acknowledgements We sincerely acknowledge the GSFC Science Foundation, Vadodara, India for financial support and Dr A.K. Lala, Biomembrane Laboratory, Indian Institute of Technology, Powai, Mumbai, India for the determination of N-terminal amino acid sequence. References Bhushan B, Hoondal GS (1998) Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase form an alkalophilic Bacillus sp. BG-11. Biotechnol. Lett. 2: 157–159. 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Microbiol. 39: 134–140. 毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。 作 者 签 名：　　 　 　　日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 指导教师签名：　　 　 　　 日　　期：　　 　 　　 使用授权说明 本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名：　　 　 　　 日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权　　 　 　大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 涉密论文按学校规定处理。 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 独 创 声 明 本人郑重声明：所呈交的毕业设计(论文)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本设计（论文）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律后果由本人承担。   作者签名: 二〇一〇年九月二十日   毕业设计（论文）使用授权声明 本人完全了解**学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定。 本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其它复制手段保存设计（论文）；同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布设计（论文）的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。 （保密论文在解密后遵守此规定）   作者签名: 二〇一〇年九月二十日 基本要求：写毕业论文主要目的是培养学生综合运用所学知识和技能，理论联系实际，独立分析，解决实际问题的能力，使学生得到从事本专业工作和进行相关的基本训练。毕业论文应反映出作者能够准确地掌握所学的专业基础知识，基本学会综合运用所学知识进行科学研究的方法，对所研究的题目有一定的心得体会，论文题目的范围不宜过宽，一般选择本学科某一重要问题的一个侧面。 毕业论文的基本教学要求是： 1、培养学生综合运用、巩固与扩展所学的基础理论和专业知识，培养学生独立分析、解决实际问题能力、培养学生处理数据和信息的能力。2、培养学生正确的理论联系实际的工作作风，严肃认真的科学态度。3、培养学生进行社会调查研究；文献资料收集、阅读和整理、使用；提出论点、综合论证、总结写作等基本技能。 毕业论文是毕业生总结性的独立作业，是学生运用在校学习的基本知识和基础理论，去分析、解决一两个实际问题的实践锻炼过程，也是学生在校学习期间学习成果的综合性总结，是整个教学活动中不可缺少的重要环节。撰写毕业论文对于培养学生初步的科学研究能力，提高其综合运用所学知识分析问题、解决问题能力有着重要意义。 毕业论文在进行编写的过程中，需要经过开题报告、论文编写、论文上交评定、论文答辩以及论文评分五个过程，其中开题报告是论文进行的最重要的一个过程，也是论文能否进行的一个重要指标。 撰写意义：1.撰写毕业论文是检验学生在校学习成果的重要措施，也是提高教学质量的重要环节。大学生在毕业前都必须完成毕业论文的撰写任务。申请学位必须提交相应的学位论文，经答辩通过后，方可取得学位。可以这么说，毕业论文是结束大学学习生活走向社会的一个中介和桥梁。毕业论文是大学生才华的第一次显露，是向祖国和人民所交的一份有份量的答卷，是投身社会主义现代化建设事业的报到书。一篇毕业论文虽然不能全面地反映出一个人的才华，也不一定能对社会直接带来巨大的效益，对专业产生开拓性的影响。但是，实践证明，撰写毕业论文是提高教学质量的重要环节，是保证出好人才的重要措施。 2.通过撰写毕业论文，提高写作水平是干部队伍“四化”建设的需要。党中央要求，为了适应现代化建设的需要，领导班子成员应当逐步实现“革命化、年轻化、知识化、专业化”。这个“四化”的要求，也包含了对干部写作能力和写作水平的要求。 3.提高大学生的写作水平是社会主义物质文明和精神文明建设的需要。在新的历史时期，无论是提高全族的科学文化水平，掌握现代科技知识和科学管理方法，还是培养社会主义新人，都要求我们的干部具有较高的写作能力。在经济建设中，作为领导人员和机关的办事人员，要写指示、 通知 关于发布提成方案的通知关于xx通知关于成立公司筹建组的通知关于红头文件的使用公开通知关于计发全勤奖的通知 、总结、调查报告等应用文；要写说明书、广告、解说词等说明文；还要写科学论文、经济评论等议论文。在当今信息社会中，信息对于加快经济发展速度，取得良好的经济效益发挥着愈来愈大的作用。写作是以语言文字为信号，是传达信息的方式。信息的来源、信息的收集、信息的储存、整理、传播等等都离不开写作。 论文种类：毕业论文是学术论文的一种形式，为了进一步探讨和掌握毕业论文的写作规律和特点，需要对毕业论文进行分类。由于毕业论文本身的内容和性质不同，研究领域、对象、方法、表现方式不同，因此，毕业论文就有不同的分类方法。 按内容性质和研究方法的不同可以把毕业论文分为理论性论文、实验性论文、描述性论文和设计性论文。后三种论文主要是理工科大学生可以选择的论文形式，这里不作介绍。文科大学生一般写的是理论性论文。理论性论文具体又可分成两种：一种是以纯粹的抽象理论为研究对象，研究方法是严密的理论推导和数学运算，有的也涉及实验与观测，用以验证论点的正确性。另一种是以对客观事物和现象的调查、考察所得观测资料以及有关文献资料数据为研究对象，研究方法是对有关资料进行分析、综合、概括、抽象，通过归纳、演绎、类比，提出某种新的理论和新的见解。 按议论的性质不同可以把毕业论文分为立论文和驳论文。立论性的毕业论文是指从正面阐述论证自己的观点和主张。一篇论文侧重于以立论为主，就属于立论性论文。立论文要求论点鲜明，论据充分，论证严密，以理和事实服人。驳论性毕业论文是指通过反驳别人的论点来树立自己的论点和主张。如果毕业论文侧重于以驳论为主，批驳某些错误的观点、见解、理论，就属于驳论性毕业论文。驳论文除按立论文对论点、论据、论证的要求以外，还要求针锋相对，据理力争。 按研究问题的大小不同可以把毕业论文分为宏观论文和微观论文。凡届国家全局性、带有普遍性并对局部工作有一定指导意义的论文，称为宏观论文。它研究的面比较宽广，具有较大范围的影响。反之，研究局部性、具体问题的论文，是微观论文。它对具体工作有指导意义，影响的面窄一些。 另外还有一种综合型的分类方法，即把毕业论文分为专题型、论辩型、综述型和综合型四大类： 1．专题型论文。这是分析前人研究成果的基础上，以直接论述的形式发表见解，从正面提出某学科中某一学术问题的一种论文。如本书第十二章例文中的《浅析领导者突出工作重点的方法与艺术》一文，从正面论述了突出重点的工作方法的意义、方法和原则，它表明了作者对突出工作重点方法的肯定和理解。2．论辩型论文。这是针对他人在某学科中某一学术问题的见解，凭借充分的论据，着重揭露其不足或错误之处，通过论辩形式来发表见解的一种论文。3．综述型论文。这是在归纳、总结前人或今人对某学科中某一学术问题已有研究成果的基础上，加以介绍或评论，从而发表自己见解的一种论文。4．综合型论文。这是一种将综述型和论辩型两种形式有机结合起来写成的一种论文。如《关于中国民族关系史上的几个问题》一文既介绍了研究民族关系史的现状，又提出了几个值得研究的问题。因此，它是一篇综合型的论文。 写作步骤：毕业论文是高等教育自学考试本科专业应考者完成本科阶段学业的最后一个环节，它是应考者的 总结 性独立作业，目的在于总结学习专业的成果，培养综合运用所学知识解决实际 问题 的能力。从文体而言，它也是对某一专业领域的现实问题或 理论 问题进行 科学 研究 探索的具有一定意义的论说文。完成毕业论文的撰写可以分两个步骤，即选择课题和研究课题。 首先是选择课题。选题是论文撰写成败的关键。因为，选题是毕业论文撰写的第一步，它实际上就是确定“写什么”的问题，亦即确定科学研究的方向。如果“写什么”不明确，“怎么写”就无从谈起。 教育部自学考试办公室有关对毕业论文选题的途径和要求是“为鼓励理论与工作实践结合，应考者可结合本单位或本人从事的工作提出论文题目，报主考学校审查同意后确立。也可由主考学校公布论文题目，由应考者选择。毕业论文的总体要求应与普通全日制高等学校相一致，做到通过论文写作和答辩考核，检验应考者综合运用专业知识的能力”。但不管考生是自己任意选择课题，还是在主考院校公布的指定课题中选择课题，都要坚持选择有科学价值和现实意义的、切实可行的课题。选好课题是毕业论文成功的一半。 第一、要坚持选择有科学价值和现实意义的课题。科学研究的目的是为了更好地认识世界、改造世界，以推动社会的不断进步和发展 。因此，毕业论文的选题，必须紧密结合社会主义物质文明和精神文明建设的需要，以促进科学事业发展和解决现实存在问题作为出发点和落脚点。选题要符合科学研究的正确方向，要具有新颖性，有创新、有理论价值和现实的指导意义或推动作用，一项毫无意义的研究，即使花很大的精力，表达再完善，也将没有丝毫价值。具体地说，考生可从以下三个方面来选题。首先，要从现实的弊端中选题，学习了专业知识，不能仅停留在书本上和理论上，还要下一番功夫，理论联系实际，用已掌握的专业知识，去寻找和解决工作实践中急待解决的问题。其次，要从寻找科学研究的空白处和边缘领域中选题，科学研究。还有许多没有被开垦的处女地，还有许多缺陷和空白，这些都需要填补。应考者应有独特的眼光和超前的意识去思索，去发现，去研究。最后，要从寻找前人研究的不足处和错误处选题，在前人已提出来的研究课题中，许多虽已有初步的研究成果，但随着社会的不断发展，还有待于丰富、完整和发展，这种补充性或纠正性的研究课题，也是有科学价值和现实指导意义的。 第二、要根据自己的能力选择切实可行的课题。毕业论文的写作是一种创造性劳动，不但要有考生个人的见解和主张，同时还需要具备一定的客观条件。由于考生个人的主观、客观条件都是各不相同的，因此在选题时，还应结合自己的特长、兴趣及所具备的客观条件来选题。具体地说，考生可从以下三个方面来综合考虑。首先，要有充足的资料来源。“巧妇难为无米之炊”，在缺少资料的情况下，是很难写出高质量的论文的。选择一个具有丰富资料来源的课题，对课题深入研究与开展很有帮助。其次，要有浓厚的研究兴趣，选择自己感兴趣的课题，可以激发自己研究的热情，调动自己的主动性和积极性，能够以专心、细心、恒心和耐心的积极心态去完成。最后，要能结合发挥自己的业务专长，每个考生无论能力水平高低，工作岗位如何，都有自己的业务专长，选择那些能结合自己工作、发挥自己业务专长的课题，对顺利完成课题的研究大有益处。 致 谢 这次论文的完成，不止是我自己的努力，同时也有老师的指导，同学的帮助，以及那些无私奉献的前辈，正所谓你知道的越多的时候你才发现你知道的越少，通过这次论文，我想我成长了很多，不只是磨练了我的知识厚度，也使我更加确定了我今后的目标：为今后的计算机事业奋斗。在此我要感谢我的指导老师——***老师，感谢您的指导，才让我有了今天这篇论文，您不仅是我的论文导师，也是我人生的导师，谢谢您！我还要感谢我的同学，四年的相处，虽然我未必记得住每分每秒，但是我记得每一个有你们的精彩瞬间，我相信通过大学的历练，我们都已经长大，变成一个有担当，有能力的新时代青年，感谢你们的陪伴，感谢有你们，这篇论文也有你们的功劳，我想毕业不是我们的相处的结束，它是我们更好相处的开头，祝福你们！我也要感谢父母，这是他们给我的，所有的一切；感谢母校，尽管您不以我为荣，但我一直会以我是一名农大人为荣。 通过这次毕业设计，我学习了很多新知识，也对很多以前的东西有了更深的记忆与理解。漫漫求学路，过程很快乐。我要感谢信息与管理科学学院的老师，我从他们那里学到了许多珍贵的知识和做人处事的道理，以及科学严谨的学术态度，令我受益良多。同时还要感谢学院给了我一个可以认真学习，天天向上的学习环境和机会。 即将结束*大学习生活，我感谢****大学提供了一次在**大接受教育的机会，感谢院校老师的无私教导。感谢各位老师审阅我的论文。 毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。 作 者 签 名：　　 　 　　日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 指导教师签名：　　 　 　　 日　　期：　　 　 　　 使用授权说明 本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名：　　 　 　　 日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权　　 　 　大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 涉密论文按学校规定处理。 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 独 创 声 明 本人郑重声明：所呈交的毕业设计(论文)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本设计（论文）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律后果由本人承担。   作者签名: 年 月 日   毕业设计（论文）使用授权声明 本人完全了解**学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定。 本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其它复制手段保存设计（论文）；同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布设计（论文）的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。 （保密论文在解密后遵守此规定）   作者签名: 年 月 日 基本要求：写毕业论文主要目的是培养学生综合运用所学知识和技能，理论联系实际，独立分析，解决实际问题的能力，使学生得到从事本专业工作和进行相关的基本训练。毕业论文应反映出作者能够准确地掌握所学的专业基础知识，基本学会综合运用所学知识进行科学研究的方法，对所研究的题目有一定的心得体会，论文题目的范围不宜过宽，一般选择本学科某一重要问题的一个侧面。 毕业论文的基本教学要求是： 1、培养学生综合运用、巩固与扩展所学的基础理论和专业知识，培养学生独立分析、解决实际问题能力、培养学生处理数据和信息的能力。2、培养学生正确的理论联系实际的工作作风，严肃认真的科学态度。3、培养学生进行社会调查研究；文献资料收集、阅读和整理、使用；提出论点、综合论证、总结写作等基本技能。 毕业论文是毕业生总结性的独立作业，是学生运用在校学习的基本知识和基础理论，去分析、解决一两个实际问题的实践锻炼过程，也是学生在校学习期间学习成果的综合性总结，是整个教学活动中不可缺少的重要环节。撰写毕业论文对于培养学生初步的科学研究能力，提高其综合运用所学知识分析问题、解决问题能力有着重要意义。 毕业论文在进行编写的过程中，需要经过开题报告、论文编写、论文上交评定、论文答辩以及论文评分五个过程，其中开题报告是论文进行的最重要的一个过程，也是论文能否进行的一个重要指标。 撰写意义：1.撰写毕业论文是检验学生在校学习成果的重要措施，也是提高教学质量的重要环节。大学生在毕业前都必须完成毕业论文的撰写任务。申请学位必须提交相应的学位论文，经答辩通过后，方可取得学位。可以这么说，毕业论文是结束大学学习生活走向社会的一个中介和桥梁。毕业论文是大学生才华的第一次显露，是向祖国和人民所交的一份有份量的答卷，是投身社会主义现代化建设事业的报到书。一篇毕业论文虽然不能全面地反映出一个人的才华，也不一定能对社会直接带来巨大的效益，对专业产生开拓性的影响。但是，实践证明，撰写毕业论文是提高教学质量的重要环节，是保证出好人才的重要措施。 2.通过撰写毕业论文，提高写作水平是干部队伍“四化”建设的需要。党中央要求，为了适应现代化建设的需要，领导班子成员应当逐步实现“革命化、年轻化、知识化、专业化”。这个“四化”的要求，也包含了对干部写作能力和写作水平的要求。 3.提高大学生的写作水平是社会主义物质文明和精神文明建设的需要。在新的历史时期，无论是提高全族的科学文化水平，掌握现代科技知识和科学管理方法，还是培养社会主义新人，都要求我们的干部具有较高的写作能力。在经济建设中，作为领导人员和机关的办事人员，要写指示、通知、总结、调查报告等应用文；要写说明书、广告、解说词等说明文；还要写科学论文、经济评论等议论文。在当今信息社会中，信息对于加快经济发展速度，取得良好的经济效益发挥着愈来愈大的作用。写作是以语言文字为信号，是传达信息的方式。信息的来源、信息的收集、信息的储存、整理、传播等等都离不开写作。 论文种类：毕业论文是学术论文的一种形式，为了进一步探讨和掌握毕业论文的写作规律和特点，需要对毕业论文进行分类。由于毕业论文本身的内容和性质不同，研究领域、对象、方法、表现方式不同，因此，毕业论文就有不同的分类方法。 按内容性质和研究方法的不同可以把毕业论文分为理论性论文、实验性论文、描述性论文和设计性论文。后三种论文主要是理工科大学生可以选择的论文形式，这里不作介绍。文科大学生一般写的是理论性论文。理论性论文具体又可分成两种：一种是以纯粹的抽象理论为研究对象，研究方法是严密的理论推导和数学运算，有的也涉及实验与观测，用以验证论点的正确性。另一种是以对客观事物和现象的调查、考察所得观测资料以及有关文献资料数据为研究对象，研究方法是对有关资料进行分析、综合、概括、抽象，通过归纳、演绎、类比，提出某种新的理论和新的见解。 按议论的性质不同可以把毕业论文分为立论文和驳论文。立论性的毕业论文是指从正面阐述论证自己的观点和主张。一篇论文侧重于以立论为主，就属于立论性论文。立论文要求论点鲜明，论据充分，论证严密，以理和事实服人。驳论性毕业论文是指通过反驳别人的论点来树立自己的论点和主张。如果毕业论文侧重于以驳论为主，批驳某些错误的观点、见解、理论，就属于驳论性毕业论文。驳论文除按立论文对论点、论据、论证的要求以外，还要求针锋相对，据理力争。 按研究问题的大小不同可以把毕业论文分为宏观论文和微观论文。凡届国家全局性、带有普遍性并对局部工作有一定指导意义的论文，称为宏观论文。它研究的面比较宽广，具有较大范围的影响。反之，研究局部性、具体问题的论文，是微观论文。它对具体工作有指导意义，影响的面窄一些。 另外还有一种综合型的分类方法，即把毕业论文分为专题型、论辩型、综述型和综合型四大类： 1．专题型论文。这是分析前人研究成果的基础上，以直接论述的形式发表见解，从正面提出某学科中某一学术问题的一种论文。如本书第十二章例文中的《浅析领导者突出工作重点的方法与艺术》一文，从正面论述了突出重点的工作方法的意义、方法和原则，它表明了作者对突出工作重点方法的肯定和理解。2．论辩型论文。这是针对他人在某学科中某一学术问题的见解，凭借充分的论据，着重揭露其不足或错误之处，通过论辩形式来发表见解的一种论文。3．综述型论文。这是在归纳、总结前人或今人对某学科中某一学术问题已有研究成果的基础上，加以介绍或评论，从而发表自己见解的一种论文。4．综合型论文。这是一种将综述型和论辩型两种形式有机结合起来写成的一种论文。如《关于中国民族关系史上的几个问题》一文既介绍了研究民族关系史的现状，又提出了几个值得研究的问题。因此，它是一篇综合型的论文。 写作步骤：毕业论文是高等教育自学考试本科专业应考者完成本科阶段学业的最后一个环节，它是应考者的 总结 性独立作业，目的在于总结学习专业的成果，培养综合运用所学知识解决实际 问题 的能力。从文体而言，它也是对某一专业领域的现实问题或 理论 问题进行 科学 研究 探索的具有一定意义的论说文。完成毕业论文的撰写可以分两个步骤，即选择课题和研究课题。 首先是选择课题。选题是论文撰写成败的关键。因为，选题是毕业论文撰写的第一步，它实际上就是确定“写什么”的问题，亦即确定科学研究的方向。如果“写什么”不明确，“怎么写”就无从谈起。 教育部自学考试办公室有关对毕业论文选题的途径和要求是“为鼓励理论与工作实践结合，应考者可结合本单位或本人从事的工作提出论文题目，报主考学校审查同意后确立。也可由主考学校公布论文题目，由应考者选择。毕业论文的总体要求应与普通全日制高等学校相一致，做到通过论文写作和答辩考核，检验应考者综合运用专业知识的能力”。但不管考生是自己任意选择课题，还是在主考院校公布的指定课题中选择课题，都要坚持选择有科学价值和现实意义的、切实可行的课题。选好课题是毕业论文成功的一半。 第一、要坚持选择有科学价值和现实意义的课题。科学研究的目的是为了更好地认识世界、改造世界，以推动社会的不断进步和发展 。因此，毕业论文的选题，必须紧密结合社会主义物质文明和精神文明建设的需要，以促进科学事业发展和解决现实存在问题作为出发点和落脚点。选题要符合科学研究的正确方向，要具有新颖性，有创新、有理论价值和现实的指导意义或推动作用，一项毫无意义的研究，即使花很大的精力，表达再完善，也将没有丝毫价值。具体地说，考生可从以下三个方面来选题。首先，要从现实的弊端中选题，学习了专业知识，不能仅停留在书本上和理论上，还要下一番功夫，理论联系实际，用已掌握的专业知识，去寻找和解决工作实践中急待解决的问题。其次，要从寻找科学研究的空白处和边缘领域中选题，科学研究。还有许多没有被开垦的处女地，还有许多缺陷和空白，这些都需要填补。应考者应有独特的眼光和超前的意识去思索，去发现，去研究。最后，要从寻找前人研究的不足处和错误处选题，在前人已提出来的研究课题中，许多虽已有初步的研究成果，但随着社会的不断发展，还有待于丰富、完整和发展，这种补充性或纠正性的研究课题，也是有科学价值和现实指导意义的。 第二、要根据自己的能力选择切实可行的课题。毕业论文的写作是一种创造性劳动，不但要有考生个人的见解和主张，同时还需要具备一定的客观条件。由于考生个人的主观、客观条件都是各不相同的，因此在选题时，还应结合自己的特长、兴趣及所具备的客观条件来选题。具体地说，考生可从以下三个方面来综合考虑。首先，要有充足的资料来源。“巧妇难为无米之炊”，在缺少资料的情况下，是很难写出高质量的论文的。选择一个具有丰富资料来源的课题，对课题深入研究与开展很有帮助。其次，要有浓厚的研究兴趣，选择自己感兴趣的课题，可以激发自己研究的热情，调动自己的主动性和积极性，能够以专心、细心、恒心和耐心的积极心态去完成。最后，要能结合发挥自己的业务专长，每个考生无论能力水平高低，工作岗位如何，都有自己的业务专长，选择那些能结合自己工作、发挥自己业务专长的课题，对顺利完成课题的研究大有益处。 致 谢 这次论文的完成，不止是我自己的努力，同时也有老师的指导，同学的帮助，以及那些无私奉献的前辈，正所谓你知道的越多的时候你才发现你知道的越少，通过这次论文，我想我成长了很多，不只是磨练了我的知识厚度，也使我更加确定了我今后的目标：为今后的计算机事业奋斗。在此我要感谢我的指导老师——***老师，感谢您的指导，才让我有了今天这篇论文，您不仅是我的论文导师，也是我人生的导师，谢谢您！我还要感谢我的同学，四年的相处，虽然我未必记得住每分每秒，但是我记得每一个有你们的精彩瞬间，我相信通过大学的历练，我们都已经长大，变成一个有担当，有能力的新时代青年，感谢你们的陪伴，感谢有你们，这篇论文也有你们的功劳，我想毕业不是我们的相处的结束，它是我们更好相处的开头，祝福你们！我也要感谢父母，这是他们给我的，所有的一切；感谢母校，尽管您不以我为荣，但我一直会以我是一名农大人为荣。 通过这次毕业设计，我学习了很多新知识，也对很多以前的东西有了更深的记忆与理解。漫漫求学路，过程很快乐。我要感谢信息与管理科学学院的老师，我从他们那里学到了许多珍贵的知识和做人处事的道理，以及科学严谨的学术态度，令我受益良多。同时还要感谢学院给了我一个可以认真学习，天天向上的学习环境和机会。 即将结束*大学习生活，我感谢****大学提供了一次在**大接受教育的机会，感谢院校老师的无私教导。感谢各位老师审阅我的论文。 1.0ml McIlvaine缓冲液 0.5ml上清酶液 0.5ml上清酶液 1.0ml McIlvaine缓冲液 0.5ml上清酶液 30℃水浴反应30min 沸水浴10min 沸水浴10min(反应组) 0.5ml1%胶体壳聚糖 各取1ml，4000rpm离心5min 30℃水浴反应30min(空白组) 加入4ml蒸馏水，混匀 沸水浴反应5min，冷水冷却 取0.5ml上清与0.5mlDNS试剂混合 以蒸馏水为对照，分别测两组的OD540