不同固定液及染色方法对显示肥大细胞的影响

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 29 卷 第 2 期 2010 年 　4 月 华 　中 　农 　业 　大 　学 　学 　报 Journal of Huazhong Agricultural University Vol. 29 　No. 2 Apr. 2010 ,199～202 收稿日期 :2009205226 ; 修回日期 :2009Ο11Ο123 国家自然科学基金项目 (30800808) 、华中农业大学科技创新项目 (2007XCX010)资助3 3 通讯作者. E2mail : lhz219 @mail . hzau. edu. cn 张高英 ,女 ,1984 年生 ,硕士研究生. 研究方向 :解剖组织胚胎学. E2mail : zgyyu @yahoo . com. cn 不同固定液及染色方法对显示肥大细胞的影响 张高英1 　杨　宇1 　罗广生2 　赵雅心1 　彭克美1 　刘华珍1 3 3 1. 华中农业大学动物医学院 ,武汉 430070 ; 2. 玉林出入境检验检疫局 ,玉林 537000 摘要 　为寻求一种较好的显示肥大细胞的方法 ,采用硫堇染色法和硫堇2甲苯胺蓝染色法分别对用不同固 定液固定的兔肠系膜中肥大细胞进行染色。结果显示 :Carnoy 氏液固定 ,硫堇染色可清楚显示肥大细胞 ,背景 干扰小 ,阳性细胞多且可见肥大细胞的脱颗粒现象 ;硫堇2甲苯胺蓝法虽然也可显示肥大细胞 ,但背景干扰大 ,不 利于对肥大细胞的观察 ;甲醛2乙醇固定 ,2 种染色方法都可清楚地显示肥大细胞 ,但阳性细胞较少 ;中性甲醛则 完全阻断肥大细胞的着色 ,2 种染色方法都不能显示肥大细胞。兔肠系膜肥大细胞有沿血管分布的趋势。研究 结果表明 :Carnoy 氏液及硫堇染液分别是兔肠系膜优良的固定液和染色液 ,可清楚显示肥大细胞。 关键词 　肥大细胞 ; 固定液 ; 染色 ; 兔 ; 肠系膜 中图分类号 　S 852. 16 　　文献标识码 　A 　　文章编号 　100022421 (2010) 0220199204 　　肥大细胞 (mast cell ,MC)广泛地分布于机体各 个器官 ,尤其是与外界环境接触的皮肤、消化道、呼 吸道、肠系膜和神经末梢周围的结缔组织内密度很 大。肥大细胞细胞质内充满了粗大而具有异染性的 嗜碱性颗粒 ,其颗粒中含有生物胺、蛋白多糖及中性 蛋白酶等多种生物活性物质 ,通过脱颗粒释放上述 生物活性物质而在动物的健康和疾病中发挥重要作 用[1 ] 。因此 ,肥大细胞的基础生物学研究引起研究 者的广泛兴趣。 显示肥大细胞的染色方法较多。其中低 p H 值 的甲苯胺蓝染色法和阿利新蓝染色法是研究哺乳动 物肥大细胞 2 种最典型的方法[223 ] 。李艳等用不含 冰醋酸的 Bouin 氏液固定 ,甲苯胺蓝染色法显示绵 羊子宫内肥大细胞 ,结果肥大细胞异染成紫色[4 ] 。 刘雪梅等用 10 %中性福尔马林液 (NBF) 固定 ,不同 p H 值甲苯胺蓝染色显示肾组织肥大细胞 ,结果肥 大细胞呈紫蓝色或紫红色[5 ] 。许乐仁等研究发现 , NBF 显著地阻断了阿尔新兰及甲苯胺兰对胡子鲶 肥大细胞的着染能力[627 ] 。杨筱珍等的研究结果显 示 ,NBF 固定的草鱼组织中阿尔新兰及甲苯胺兰染 色则完全不能鉴定出肥大细胞[8 ] 。 上述研究结果表明 ,肥大细胞对某些固定液、染 液及染色条件比较敏感 ,染色效果很不稳定[ 9 ] 。因 此 ,笔者选用肥大细胞密度较高的肠系膜为对象 ,分 别采用 3 种不同固定液及 2 种染色方法来探讨其对 显示肥大细胞的影响 ,旨在找到一种较好的显示肥 大细胞的方法 ,为肥大细胞的基础生物学研究积累 资料。 　材料与方法 　肠系膜铺片的制备 健康大白兔 5 只 ,耳静脉注射空气致死后打开 腹腔 ,用脱脂棉轻轻吸去少量腹水后取肠系膜。将 肠系膜展平在 12 mm ×12 mm 干净的盖玻片上 ,用 眼科剪沿盖玻片边缘剪下 (注意剪的时候不要用力 牵拉肠系膜 ,否则容易回缩变厚) ,稍微风干后连同 盖玻片一起分别投入 Carnoy 固定液 ( V 无水乙醇 ∶ V 氯仿 ∶V 冰醋酸 = 6 ∶3 ∶1) 、甲醛乙醇液 ( V 甲醛 ∶ V 无水乙醇 = 1 ∶9) 、中性甲醛固定液中固定 1～2 h。 　染 　色 铺片连同盖玻片一起从固定液中取出 ,浸入 100 %乙醇下行至 70 %乙醇各 1 min 后分别浸入染 液[10211 ] 。 浸入硫堇染液 (硫堇 0. 5 g ,蒸馏水 100 mL) 30 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 29 卷 　 min 后取出蒸馏水稍洗 ,用吸水纸吸去多余水分 ,稍 晾干后用无水丙酮脱水 (不能用乙醇脱水 ,极易掉 色) 2 次 ,每次 5 min ,二甲苯透明后将中性树胶滴于 干净的载玻片上 ,将盖玻片上有组织的一面朝下封 固于载玻片上。 浸入 0. 5 %硫堇水溶液 (硫堇 0. 5 g ,蒸馏水 100 mL)染色 5 min 后取出蒸馏水洗 ,再浸入 1 %甲 苯胺蓝乙醇溶液 (甲苯胺蓝 1 g ,70 %乙醇 100 mL ) 染色5 min ,蒸馏水洗 ,95 %乙醇分色 ,显微镜下控制 分色时间 ,无水乙醇脱水 2 次 ,每次 5 min ,二甲苯 透明 ,按上述相同方法中性树胶封固。 　结果与分析 　 氏液固定后染色结果 采用硫堇染色法 ,可清楚显示肥大细胞 ,背景为 浅蓝色 ,阳性肥大细胞呈紫红色 (图 12A) ,数量较 多。细胞椭圆形或卵圆形 ,还可见长梭形 ,胞浆内有 大量的紫红色颗粒 ,胞核大而圆呈浅蓝色多位于中 央 ,也有偏核 ,同时清晰可见肥大细胞的脱颗粒现象 (图 12B) 。阳性肥大细胞大部分沿血管分布。 采用硫堇2甲苯胺蓝染色法 ,阳性肥大细胞为蓝 紫色 ,其它细胞被染成深蓝色 ,对比度减弱 (图 12C) 。 　A. 硫堇染色 ,紫红色肥大细胞数量多 ,沿血管分布 ,箭头所示为血管 ( ×200) Stained wit h t hionine ,many prunosus mast cells locate along vascellum ,t he arrow shows vascellum( ×200) ; B. 硫堇染色 ,可见肥大脱颗粒现象 ,如箭头所示 ( ×400) Stained wit h t hionine ,t he arrow shows degranulation of mast cells ( ×400) ; C. 硫堇2甲苯胺蓝染色 ,肥大细胞蓝紫色 ,如箭头所示 ,背景细胞深蓝色 ,对比度不明 显 ( ×400) Stained wit h t hionine2toluidine blue ,t he arrow shows amet hyst mast cells ,t he cells in background are mazarine and t he con2 t rast is not obvious( ×400) . 图 1 　Carnoy 氏液固定后肥大细胞的染色结果 Fig. 1 　The re sults of staining of mast cells fixed in Carnoy 　 液固定后染色结果 采用硫堇染色法和硫堇2甲苯胺蓝染色结果相 似 ,都可清楚显示肥大细胞 ,背景为浅蓝色 ,肥大细 胞呈紫红色 ,数量较少 ,沿小血管分布 (图 22A) ,阳 性细胞胞浆内有大量的紫红色颗粒 (图 22B) 。 　中性甲醛固定后染色结果 中性甲醛固定的铺片分别用 2 种方法染色都未 见有紫红色的阳性细胞 ,只有大量浅染的蓝色细胞 (图 3) 。 　讨　论 肥大细胞是疏松结缔组织中常见的细胞 ,常成 群地沿着小血管和小淋巴管分布 ,其数量随动物和 器官的不同而异。肠系膜是典型的疏松结缔组织 , 富含大量的肥大细胞。以前都采用大白鼠或小白鼠 的肠系膜制作疏松结缔组织铺片 ,但实验动物较小 不便于取材与操作 ,且制作的铺片有可能厚薄不均 影响染色效果[11 ] 。本试验采用大白兔为研究对象 , 盖玻片粘贴肠系膜直接染色 ,方法简单 ,不需别的处 理且制作的铺片不易回缩变厚 ,不失为一种好的铺 片制作方法。 肥大细胞在组织化学染色及形态上具有极大的 异质性 ,并且极大程度地受到固定液的影响[ 2 ] 。肥 大细胞中含有组织胺、肝素等异染性物质 ,其与硫堇 甲苯胺蓝结合后表现出异染性 ,呈现紫红色或蓝紫 色。本试验证明 Carnoy 固定肥大细胞染色最好 , 与高登慧等研究结果[ 12 ]相同。FA 也为肥大细胞的 一种较好的固定剂。硫堇染色对肥大细胞的显示效 果最好 ,其它细胞几乎不着色或着浅蓝色 ,突显了肥 大细胞 ,便于肥大细胞的观察与研究。硫堇与甲苯 胺蓝都是研究肥大细胞常用的碱性染料 ,通常是单 独使用来鉴别肥大细胞。而柳洁等 [ 11 ] 采用二者联 合使用的方法来制取疏松结缔组织铺片 ,同时使 肥大细胞与胶原纤维等着色。本试验借鉴该法 , 002 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　第 2 期 张高英 等 : 不同固定液及染色方法对显示肥大细胞的影响 　 　A. 硫堇染色 ,肥大细胞数量较少 ,沿血管分布 ,箭头所示为血 管 ( ×200) Stained wit h t hionine ,a few prunosus mast cells locate along vascellum ,t he arrow shows vascellum ( ×200) ; B. 硫堇2甲 苯胺蓝染色 ,胞浆内有大量的紫红色颗粒 ,如箭头所示 ( ×400) Stained wit h t hionine2toluidine ,t here were lot s of prunosus gran2 ules in mast cells ( ×400) . 图 2 　FA 固定后肥大细胞的染色结果 Fig. 2 　The results of staining of mast cells fixed in FA 图 3 　中性甲醛固定后肥大细胞的 染色结果 ,箭头所示为血管 ( ×200) Fig. 3 　The results of staining of mast cells fixed in neutral formalin ,the arrow shows vascellum( ×200) 虽可显示肥大细胞但背景较深 ,不便于肥大细胞的 观察。 　　试验中相同的组织同样的染色方法 ,由中性甲 醛固定则完全不能显示肥大细胞。但有学者证实大 鼠肥大细胞在甲醛固定甲苯胺蓝染色时数量改变不 明显[ 13 ] 。目前认为 ,甲醛对染料的阻断作用是可逆 的 ,主要是有关的蛋白发生交联 ,形成蛋白质分子的 弥散屏障 ,从而阻断了染料的扩散[3 ] 。而笔者推测 有几种可能 : (1) 甲苯胺蓝、硫堇等碱性染料是通过 其中有染色作用的阳离子与组织细胞中酸性多聚阴 离子物质相结合而使细胞着色 ,由此推测可能是由 于细胞中的多聚阴离子不同造成 ; (2)肥大细胞在不 同物种之间存在不同的类型 ; (3)不同组织器官中的 不同微环境影响了肥大细胞的功能 ,改变了其形态 和颗粒内容物 ; (4)不同的固定液可以针对性地改变 细胞内空间构型 ,从而起到固定的效果 ,进而影响了 其染色结果。笔者认为在对肥大细胞的组织化学染 色中存在诸多的易变因素 ,所以单纯地从组织学染 色方面不足以证明肥大细胞的存在 ,可以从免疫组 织化学方面如凝集素[ 14 ]等来进一步证明肥大细胞。 以后研究组织中的肥大细胞一定要注意对固定液、 染料及染色方法的选择。 本研究不但为肥大细胞的形态学研究提供了有 益的资料 ,而且对显示肥大细胞染色方法的评价提 出了有价值的参考依据。 参 考 文 献 [ 1 ] 　IRANI A A , SCHWAR TZ L B. Mast cell heterogeneity [ J ] . Clin Exp Allergy ,1989 ,19 (2) :1432155. [ 2 ] 　MA YR HOFER G. Fixation and staining of granules in mucosal mast cells and int raepit helial lymphocytes in t he rat jejunum , wit h special reference to t he relationship between t he acid gly2 cosaminoglycans in t he two cell types[J ] . Histochem J ,1980 , 12 (5) :5132526. [ 3 ] 　WIN GREN U , EN ERBACK L . Mucosal mast cells of t he rat intestine :a re2evaluation of fixation and staining properties ,with special reference to protein blocking and solubility of the granular glucosaminoglycan[J ] . Histochem J ,1983 ,15 (6) :5712582. [ 4 ] 　李艳 ,杨立霞. 绵羊子宫肥大细胞的观察[J ] . 呼伦贝尔学院学 报 ,2007 ,15 (1) :66267. [ 5 ] 　刘雪梅 ,朱红艳 ,甄晖 ,等. 肾组织肥大细胞的形态学特点及染 色方法[J ] . 临床与实验病理学杂志 ,2004 ,20 (2) :2162219. [ 6 ] 　XU L R , YAN G X Z , GAO D H ,et al . Mast cells in two species of freshwater fishes ,grass fish ( Ctem phary ngodon i del l a) and cat fish ( Claris f uscas lacepeda) [J ] . J Anim Vet Adv ,2003 ,2 (3) :1912195. [7 ] 　许乐仁 ,杨筱珍 ,高登慧. 草鱼淋巴器官中的肥大细胞[J ] . 水产 学报 ,2003 ,27 (3) :2332237. [ 8 ] 　杨筱珍 ,高登慧 ,许乐仁. 胡子鲇肥大细胞的组织化学及形态学 [J ] . 中国水产科学 ,2003 ,10 (2) :1062110. [9 ] 　J UL IANA S R , HEL IO C G. Mast cell heterogeneity between two different species of Hoplias sp . (Characiformes : Eryt hrini2 dae) :response to fixatives ,anatomical dist ribution ,histochemi2 cal content s and ult rast ructural features[J ] . Fish Shellfish Im2 102 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 29 卷 　 munol ,2007 ,22 (3) :2182229. [ 10 ] 杜卓民. 实用组织学技术 [ M ] . 北京 :人民卫生出版社 ,1982 : 80. [ 11 ] 柳洁 ,马晓健. 疏松结缔组织铺片显示肥大细胞的一种新方法 [J ] . 解剖科学进展 ,2005 , 11 (3) :282. [ 12 ] 高登慧 ,许乐仁 ,姚红艳. 山羊肥大细胞组织化学及形态学研究 [J ] . 畜牧兽医学报 ,2000 ,31 (1) :88293. [ 13 ] ALDENBOR G F ,EN ERBACK L . Histochemical heterogeneityof dermal mast cells in at hymic and nomal rat s[J ] . HistochemJ ,1988 ,20 (1) :19228.[ 14 ] SIVRIDIS N , GIA TROMANOL A KI A , A GNAN TIS N K ,etal . Mast cell dist ribution and density in t he normal uterus2metachromatic staining using lectins[J ] . Eur J Obstet GynecolReprod Biol ,2001 ,98 (1) :1092113. Effect of Different Fixatives and Stainings on Presenting Mast Cells ZHAN G Gao2ying1 　YAN G Yu1 　L UO Guang2sheng2 ZHAO Ya2xin1 　PEN G Ke2mei1 　L IU Hua2zhen1 1 . Col lege of V eteri nary Medici ne , H uaz hong A g ricul t ural Uni versi t y , W uhan 430070 , Chi na; 2 . Yuli n Ent ry2Ex i t I ns pection and Quaranti ne B ureau , Yul i n 537000 , Chi na Abstract 　In t he p resent study , rabbit mesentery was fixed in three different fixatives and stained with thionine and t hionine2toluidine blue respectively in order to find a good met hod to display mast cells . The result s showed t hat lot s of positive mast cells wit h light background could be presented clearly by Carnoy fixative and t hionine staining. In addition ,degranulation of some mast cells could be observed clearly. However ,it was difficult to observe positive mast cells by Carnoy fixative and t hionine2toluidine blue staining because of high interferential background. Only a lit tle positive mast cells could be observed t hrough formaldehyde2alcohol fixative and t he two staining methods. Neut ral formalin blocked t he stai2 ning of mast cells completely ,for neit her of the staining met hods could display mast cells. Most of t he positive mast cells were dist ributed along t he blood vessels. The result s demonst rated t hat Carnoy and t hionine were superordinary fixative and staining solution for clearly displaying mast cells of rabbit mes2 entery ,respectively. Key words 　mast cell ; fixative ; staining ; rabbit ; mesentery (责任编辑 :边书京) 202